提高黔淫羊藿的質量標準研究

祝清燦，孫宜春，羅 倩，羅文平，劉 凱，李慧馨，王 杏，段 麗

國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴陽 550026

黔淫羊藿為小蘗科植物粗毛淫羊藿EpimediumacuminatumFranch、天平山淫羊藿EpimediummyrianthumSteam、氈毛淫羊藿EpimediumcoactumH.R.Liang et W.M.Yan及黔嶺淫羊藿EpimediumleptorrhizumStearn的干燥地上部分，無臭，味微苦，夏秋二季莖葉茂盛時采收，為《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》收錄的貴州省少數民族用藥[1]，主要分布于四川、貴州、云南、湖北、廣西等省區[2-4]，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效[5-7]，臨床主要用于治療陽痿遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛、麻木拘攣等癥[8]。研究表明，淫羊藿屬植物中主要含黃酮、木脂素、生物堿、揮發油、苯酚苷、多糖及微量元素等成分[9-10]，具有補肝腎、強筋骨、祛風濕、抗衰老、提高免疫力、抑制腫瘤、抑制骨吸收等藥理作用[11-14]。黔淫羊藿現行標準項下僅收載性狀、薄層鑒別、含量測定等檢測項目。本研究增加了顯微鑒別、水分和灰分、浸出物檢查項目，改進了薄層鑒別方法，用高效液相色譜法進行含量測定，為質量標準修訂提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Vanquish型高效液相色譜儀(在線脫氣，六元泵，二級管陣列檢測器，工作站，賽默飛世爾科技有限公司)；ME204TE/02型電子天平(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司)；SB25-12DTS型數控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Goodsee-Ⅱ型紫外分析儀(上海科哲生化科技有限公司)；202-2AB型電熱鼓風干燥箱(上海路達實驗儀器有限公司)。色譜柱：太瑋科技JADE-PAK ODS-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)；安捷倫 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；菲羅門Superlu C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；依利特HypersilBDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；迪馬Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試藥

朝藿定C(批號110738-201905)，淫羊藿苷(批號110731-201518，含量94.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)；乙腈為色譜純，水為自制純化水，其他試劑均為分析純。

粗毛淫羊藿、天平山淫羊藿、氈毛淫羊藿、黔嶺淫羊藿原植物及樣品均由國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司種植部提供，且經貴州中醫藥大學藥學院何順志教授鑒定，分別為小蘗科Berberidaceae淫羊藿屬Epimedium植物粗毛淫羊藿EpimediumacuminatumFranch、天平山淫羊藿EpimediummyrianthumSteam、氈毛淫羊藿EpimediumcoactumH.R.Liang et W.M.Yan及黔嶺淫羊藿EpimediumleptorrhizumStearn的干燥地上部分。憑證標本存放于國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司。樣品來源見表1。

表1 樣品來源

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

將葉片用水浸泡后擦干，分別撕取上表皮及下表皮，制片，透化，置顯微鏡下進行觀察。粗毛淫羊藿葉：表面觀，上、下表皮細胞垂周壁深波狀彎曲。下表皮氣孔眾多，圓形或類圓形，不定式。非腺毛多見，粗短，先端鈍圓，多數頂端細胞極長，基部細胞較短。沿葉脈有異細胞縱向排列，內含多個草酸鈣柱晶，形成明顯的晶鞘纖維。天平山淫羊藿非腺毛多見，細長，先端較尖。氈毛淫羊藿非腺毛密集交錯，柔軟，彎曲，基部細胞較小。黔嶺淫羊藿非腺毛少見。見圖1。

注：A.上表皮細胞；B.下表皮細胞；C.氣孔；D.草酸鈣柱晶；E.粗毛淫羊藿非腺毛；F.天平山淫羊藿非腺毛；G.氈毛淫羊藿非腺毛。

2.2 薄層鑒別

取黔淫羊藿粉末(過3號篩)1 g，加石油醚(60 ℃～90 ℃)20 mL，加熱回流30 min，濾過，棄去濾液，濾渣加乙醇25 mL，超聲提取30 min(功率600 W，頻率40 kHz)，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使其溶解，用水飽和的正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使其溶解，作為供試品溶液[15]。另取淫羊藿苷對照品、朝藿定C對照品，分別加甲醇制成1 mg·mL-1溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法(TLC)實驗操作[16]，分別吸取對照品溶液和供試品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8∶1∶0.5)為展開劑，預飽和20 min，展開，取出，晾干，噴以100 g·L-1的三氯化鋁乙醇試液，105 ℃下加熱3～6 min，置于紫外光燈365 nm處檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。結果見圖2。

注：1、2.粗毛淫羊藿；3、4.氈毛淫羊藿； 5、6.天平山淫羊藿；7、8.黔嶺淫羊藿；9.淫羊藿苷、朝藿定C對照品；10.淫羊藿苷對照品。

2.3 水分、總灰分和浸出物

按《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版[16]，分別測定黔淫羊藿中的水分、總灰分和浸出物的含量(%)。12批樣品水分平均值為9.50%，以平均值的120%設限則為11.40%，故建議將水分標準定為不得大于12%；總灰分平均值為6.42%，以平均值的120%設限則為7.70%，故建議將總灰分標準定為不得大于8%；浸出物平均值為18.72%，以平均值的80%設限則為14.98%，故建議將浸出標準定為不得少于15%。結果見表2。

表2 黔淫羊藿水分、灰分和浸出物測定結果

2.4 淫羊藿苷和朝藿定C含量測定

2.4.1供試品溶液的制備 取本品粉末(過3號篩)約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 Hz)1 h，放冷，再稱定質量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，取上清液，濾過，取續濾液，作為供試品溶液[17-18]。

2.4.2混合對照品溶液的制備 取朝藿定C對照品及淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇，制成分別含朝藿定C 0.20 mg·mL-1、淫羊藿苷0.02 mg·mL-1的混合溶液，作為對照品溶液。

2.4.3空白對照溶液的制備 取稀乙醇作為陰性樣品溶液。

2.4.4色譜條件與系統適用性實驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(30∶70)為流動相；檢測波長為270 nm；流速為1 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL；理論板數按朝藿定C峰計算應不低于6 000。

2.4.5專屬性 分別取2.4.1、2.4.2、2.4.3項下對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液各10 μL，按2.4.4項下色譜條件進行測定，結果表明，陰性樣品無干擾，見圖3[19]。

注：A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液；1.朝藿定C；2.淫羊藿苷。

用二級管陣列檢測器對供試品溶液中的淫羊藿苷和朝藿定C色譜峰進行峰光譜掃描和質量分數檢測，結果峰質量分數角度<峰質量分數閾值，供試品中淫羊藿苷和朝藿定C光譜圖與譜庫中淫羊藿苷和朝藿定C光譜圖匹配理想，說明淫羊藿苷和朝藿定C峰為純峰，專屬性強，符合要求。

2.4.6線性關系考察 精密吸取2.4.2項下朝藿定C、淫羊藿苷對照品0.5、1、2、5、7、10 mL，分別置于10 mL的量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按2.4.4項下色譜條件，測定各自峰面積。以對照品的質量濃度(μg·mL-1)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，得標準曲線，求得朝藿定C的回歸方程：y=31.619x+0.037 4，r2=0.999 9，線性范圍為10.27～205.38 μg·mL-1；求得淫羊藿苷的回歸方程：y=37.535x+0.0245，r2=0.999 9，線性范圍為2.50～49.95 μg·mL-1。結果表明，朝藿定C質量濃度在10.27～205.38 μg·mL-1范圍內與峰面積值呈良好的線性關系；淫羊藿苷質量濃度在2.50～49.95 μg·mL-1范圍內與峰面積值呈良好的線性關系；可用外標一點法計算含量。

2.4.7精密度實驗 精密吸取朝藿定C、淫羊藿苷對照品混合溶液(朝藿定C 0.2 mg·mL-1，淫羊藿苷20 μg·mL-1)10 μL，按2.4.4項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，朝藿定C、淫羊藿苷峰面積之和的RSD值為0.12%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.4.8重復性實驗 取黔淫羊藿(批號20170501)粉末(過3號篩)，混勻，取6 份，每份約0.2 g，精密稱定，按2.4.3供試品溶液制備方法及色譜條件測定。朝藿定C、淫羊藿苷峰面積之和的RSD≤3.0%，表明該方法的重復性良好。

2.4.9穩定性實驗 取2.4.8重復性實驗制備的供試品溶液，按2.4.4項下色譜條件，分別于0、4、8、12、16、24 h測定淫羊藿苷和朝藿定C的總峰面積[19]。結果表明，朝藿定C及淫羊藿苷之和的RSD 為0.89%，表明朝藿定C及淫羊藿苷在24 h內基本穩定。

2.4.10色譜柱考察 取黔淫羊藿(批號20170501)，用5種品牌的色譜柱測定淫羊藿苷和朝藿定C的含量。色譜柱：太瑋科技JADE-PAK ODS-AQ(250 mm×4.6 mm，5 μm)，安捷倫 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，菲羅門Superlu C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，依利特HypersilBDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，迪馬Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。結果顯示，2個色譜峰分離良好，含量測定結果無顯著差異，朝藿定C、淫羊藿苷峰面積之和的RSD值為2.3%，表明測定方法的耐用性較好。

2.4.11加樣回收實驗 取已知含量的黔淫羊藿(批號20170501)，混勻，取6份，每份約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，每份分別加混合對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按2.4.1項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按2.4.4項下色譜條件測定，計算朝藿定C和淫羊藿苷回收率，見表3、表4。朝藿定C平均回收率為101.62%，RSD為0.22%；淫羊藿苷的平均回收率為93.72%，RSD為0.21%；表明方法的準確度較好。

表3 朝藿定C加樣回收率實驗結果

表4 淫羊藿苷加樣回收率實驗結果

2.4.12樣品含量測定 取粗毛淫羊藿溶液、氈毛淫羊藿溶液、天平山淫羊藿溶液、黔嶺淫羊藿各3批，按2.4.1項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按2.4.4項下色譜條件進行測定，結果見表5。

表5 黔淫羊藿中朝藿定C與淫羊藿苷含量之和測定結果

根據測定結果，考慮到各種藥材原料含量的波動，建議暫定粗毛淫羊藿含朝藿定C(C39H50O15)與淫羊藿苷(C33H40O15)含量之和不得少于0.2%；氈毛淫羊藿和天平山淫羊藿含朝藿定C(C39H50O15)與淫羊藿苷(C33H40O15)含量之和不得少于1.0%；黔嶺淫羊藿中朝藿定C(C39H50O15)與淫羊藿苷(C33H40O15)含量之和的平均值為0.05%，因含量過低，故對黔嶺淫羊藿中朝藿定C(C39H50O15)與淫羊藿苷(C33H40O15)暫不收入標準正文。

3 討論

3.1 TLC供試品溶液制備

根據化學成分的溶解性，分別對以下條件進行考察：提取溶劑(石油醚、甲醇、乙醇)，提取方法(超聲、回流)，提取溶劑用量(15、25、35 mL)，正丁醇萃取次數(1、2次)。結果表明，按本文2.3項下制備的供試品溶液鑒別斑點最清晰[20]。

3.2 薄層色譜條件考察

根據展開樣品主要化學成分的極性，對以下條件進行了考察：展開系統如：水飽和的正丁醇，石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4∶2)，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(1.5∶4∶0.7)，正己烷-乙酸乙酯-甲酸(3∶1∶0.15)，乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1.3∶1)，三氯甲烷-甲醇-水-甲酸(6.5∶3.5∶1.5∶0.5)；硅膠板種類(硅膠G板、硅膠H板，硅膠GF254板)；點樣量(3、5、10、15 μL)；條帶點樣寬度(5、6、7、8 mm)；薄層板預平衡時間(10、20、30 min)；展開溫度(10、20、30 ℃)[20]。結果表明，按2.2項下色譜條件，供試品與對照品及對照藥材在不同的檢視條件下色譜條帶數較多，展開效果較好，分離度較好。

3.3 高效液相色譜法(HPLC)供試品溶液制備

分別對以下條件進行考察：提取溶劑(甲醇、不同濃度乙醇)，提取方法(超聲、回流)，提取溶劑用量(30、50、70 mL)，提取時間(0.5、1.0、1.5 h)。結果表明，按2.4.1項下方法制備的供試品溶液峰面積最大[20]。

3.4 HPLC色譜條件選擇

分別考察以乙腈-水(25∶75)。乙腈-水(30∶70)和乙腈-水(35∶65)為流動相時的分離情況，結果表明，以乙腈-水(30∶70)為流動相，各色譜峰的分離效果較好。用二極管陳列檢測器對供試品溶液中淫羊藿苷和朝藿定C在210～400 nm波長范圍內進行全波長掃描，結果表明，淫羊藿苷在波長為270 nm處的峰質量分數較高，峰面積最大，由此確定檢測波長為270 nm。

本研究對黔淫羊藿進行了顯微鑒別，對水分、總灰分、浸出物進行測定，改進了薄層色譜鑒別方法，改用高效液相色譜法測定黔淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定C含量，該方法專屬性較強，穩定性、重復性、耐用性較好，準確度較高，為黔淫羊藿的質量控制標準的提高提供科學依據。