HPLC法同時測定四季抗病毒合劑中17種成分的含量

王麗麗，趙 榮，何 悅，許 璐，雷美娜，彭 真，王四旺，肖會敏*

1.西安航天總醫(yī)院，西安 710199；2.陜西海天制藥有限公司，咸陽 712000；3.陜西含光生物科技有限公司，西安 710032；4.西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，西安 710069

手足口病是由腸道病毒引起的傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童，表現(xiàn)為口痛、厭食、低熱，以及手、足、口腔等部位出現(xiàn)小皰疹或小潰瘍，多數(shù)患兒1周左右自愈，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，目前尚無特效藥。四季抗病毒合劑對手足口病與呼吸道感染具有較好的療效[1-10]。四季抗病毒合劑(國藥準(zhǔn)字Z20027669)由魚腥草、桔梗、桑葉、連翹、荊芥、薄荷、紫蘇葉、苦杏仁、蘆根、菊花、甘草11味中藥組成，具有清熱解毒、消炎退熱的功能，用于治療上呼吸道感染、病毒性感冒、流感、腮腺炎等病毒性感染性疾病。經(jīng)檢索文獻(xiàn)，四季抗病毒合劑有含量測定研究[11-14]及抗手足口病基礎(chǔ)研究[15-17]；四季抗病毒合劑中含有新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎寧酸、連翹酯苷B、連翹酯苷A、異槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、迷迭香酸、連翹苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫蘇醛等成分[18-27]，但發(fā)現(xiàn)未有同時測定新綠原酸、綠原酸、咖啡酸等17種成分的研究報道。因此，本研究用高效液相色譜(HPLC)法同時測定制劑中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸等17種成分的含量，為控制本品質(zhì)量、表征制劑中的主要活性成分提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Prominence UFLC高效液相色譜儀(日本島津公司)；Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典AKZO NOBEL公司)；BSA124S型電子分析天平(賽多利斯公司)；KQ-5200DE臺式數(shù)控超聲波清洗器(上海虔鈞科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

四季抗病毒合劑(批號170201～170210)，魚腥草，桔梗，桑葉，連翹，荊芥，薄荷，紫蘇葉，苦杏仁，蘆根，菊花，甘草(由陜西海天制藥有限公司提供)。對照品：新綠原酸(批號MUST-10091501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，購自成都曼思特生物科技有限公司；綠原酸(批號110753-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.3%)、咖啡酸(批號110885-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.7%)、1,3-O-二咖啡酰奎寧酸(批號111717-201402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94.5%)、連翹酯苷B(批號111811-201603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.6%)、連翹酯苷A(批號111810-201606，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93.4%)、異槲皮苷(批號111809-201403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥92.9%)、甘草苷(批號111610- 201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93.1%)、阿魏酸(批號110773-201614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)、橙皮苷(批號110721-201617，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.1%)、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸(批號111782-201405，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、迷迭香酸(批號111871-201706，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90.5%)、連翹苷(批號110821-201615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94.9%)、蒙花苷(批號111528-201710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.6%)、槲皮素(批號100081-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.8%)、甘草酸(批號110731-201619，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥93%)、紫蘇醛(批號111806-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94.4%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純(美國Honeywell公司)。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫程序見表1；檢測波長為277、254 nm；記錄時間為75 min；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 分別精密稱取新綠原酸6.90 mg、綠原酸4.80 mg、咖啡酸10.00 mg、1,3-O-二咖啡酰奎寧酸11.00 mg、連翹酯苷B 16.60 mg、連翹酯苷A 18.00 mg、異槲皮苷22.00 mg、甘草苷6.40 mg、阿魏酸6.90 mg、橙皮苷8.00 mg、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸9.80 mg、迷迭香酸4.40 mg、連翹苷6.10 mg、蒙花苷4.10 mg、槲皮素11.20 mg、甘草酸6.50 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，再精密稱取紫蘇醛10.6 mg加入量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得17種混合對照品溶液，其質(zhì)量濃度分別為676.20、476.64、997.00、1 039.50、1 603.56、1 681.20、2 043.80、595.84、683.10、768.80、960.40、398.20、578.89、396.06、1 117.76、604.50、1 000.64 μg·mL-1，作為儲備液。

2.2.2供試品溶液 取四季抗病毒合劑，精密量取1.0 mL，置于5 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液 根據(jù)四季抗病毒合劑處方，分別制備缺連翹(即連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷陰性對照品)，缺甘草(即甘草苷與甘草酸陰性對照品)，缺紫蘇葉(即紫蘇醛陰性對照品)、缺菊花、魚腥草(即1,3-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、新綠原酸、綠原酸、異槲皮苷的陰性對照品)，缺菊花、薄荷(即橙皮苷、蒙花苷陰性對照品)，缺紫蘇葉、荊芥和蘆根(即咖啡酸、迷迭香酸、阿魏酸陰性對照品)，缺菊花、桑葉和魚腥草(即槲皮素陰性對照品)的模擬制劑，再根據(jù)2.2.2項分別制備相應(yīng)的陰性對照溶液。

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系

吸取2.2.1項儲備液12.5、62.5、312.5、625.0、1 250.0、2 500.0 μL，分別置于5 mL量瓶中，分別加甲醇至刻度，即得由新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎寧酸、連翹酯苷B、連翹酯苷A、異槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、迷迭香酸、連翹苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫蘇醛17種成分組成的系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，即1、2、3、4、5、6，分別用0.45μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣測得峰面積。以各對照品的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積值為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)(r)，見表2。結(jié)果表明，17種對照品在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系測定結(jié)果

3.2 專屬性實驗

分別精密量取混合對照溶液、供試品溶液、各種陰性對照溶液各5 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果，陰性對照品無干擾，各峰分離度良好，見圖1，表明該方法專屬性強。

注：A.混合對照品(277 nm)；B.混合對照品(254 nm)；C.四季抗病毒合劑(277 nm)；D.四季抗病毒合劑(254 nm)；E.缺連翹對照品(即連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷陰性對照品，277 nm)；F.缺甘草對照品(即甘草苷與甘草酸陰性對照品，277 nm)；G.缺紫蘇葉對照品(即紫蘇醛陰性對照品，254 nm); H.缺菊花、魚腥草對照品(即1,3-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、新綠原酸、綠原酸、異槲皮苷的陰性對照品，277 nm)；I.缺菊花、薄荷對照品(即橙皮苷、蒙花苷陰性對照品，277 nm)；J. 缺紫蘇葉、荊芥和蘆根對照品(即咖啡酸、迷迭香酸、阿魏酸陰性對照品，277 nm)；K.缺菊花、桑葉和魚腥草對照品(即槲皮素陰性對照品，277 nm)；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.咖啡酸；4. 1,3-O-二咖啡酰奎寧酸；5.連翹酯苷B；6.連翹酯苷A；7.異槲皮苷；8.甘草苷；9.阿魏酸；10.橙皮苷；11. 3,5-O-二咖啡酰奎寧酸；12.迷迭香酸；13.連翹苷；14.蒙花苷；15.槲皮素；16.甘草酸；17.紫蘇醛。

3.3 精密度實驗

取混合對照品溶液6，按照2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎寧酸、連翹酯苷B、連翹酯苷A、異槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、迷迭香酸、連翹苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫蘇醛的峰面積的RSD值分別為1.87%、1.51%、1.32%、1.67%、1.49%、0.52%、1.57%、1.86%、0.90%、0.76%、1.32%、1.29%、0.18%、0.16%、0.62%、0.72%、0.18%，表明該方法精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性實驗

取混合對照品溶液6，分別在第0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎寧酸、連翹酯苷B、連翹酯苷A、異槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、迷迭香酸、連翹苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫蘇醛的峰面積的RSD值分別為0.18%、0.57%、0.60%、0.43%、0.19%、0.11%、0.21%、0.30%、0.26%、0.17%、1.11%、1.20%、0.30%、0.33%、0.14%、0.49%、1.25%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性實驗

精密稱取6份樣品(批號170202)，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，各成分含量的RSD值均小于2%，見表3，表明該方法重復(fù)性好。

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果

3.6 加樣回收實驗

精密量取四季抗病毒合劑(批號170202)0.50 mL，按要求添加對照品，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，共制備6份樣品，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣并測定峰面積，計算各成分的平均回收率(%)及RSD(%)。結(jié)果各成分平均回收率均大于96%，RSD值均小于2%。

3.7 含量測定

精密量取10批四季抗病毒合劑樣品，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。10批樣品中各成分含量的RSD值均小于2%，見表4，說明批次間各成分含量變化較小。

表4 四季抗病毒合劑中17種成分含量測定結(jié)果

4 討論

4.1 檢測波長的選定

用二極管陣列檢測器對本試驗所測定的17種成分進(jìn)行全波長分析，最大吸收波長不一，新綠原酸(325 nm)、綠原酸(326 nm)、咖啡酸(322 nm)、1,3-O-二咖啡酰奎寧酸(321 nm)、連翹酯苷B(330 nm)、連翹酯苷A(329 nm)、異槲皮苷(255、354 nm)、甘草苷(276 nm)、阿魏酸(322 nm)、橙皮苷(283 nm)、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸(327 nm)、迷迭香酸(329 nm)、連翹苷(228、278 nm)、蒙花苷(268、334 nm)、槲皮素(255、371 nm)、甘草酸(250 nm)、紫蘇醛(232 nm)。經(jīng)過篩選200、254、277、320、348 nm波長，考察各波長的色譜信息，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，除紫蘇醛以外的其他16種成分在277 nm處各峰分離度好，基線平穩(wěn)，且峰形較好；紫蘇醛在波長254 nm處檢出峰形較好，且其他峰也可顯示。因此選擇254 nm作為紫蘇醛檢測波長，其余16種成分選用277 nm。

4.2 其他色譜條件的選定

比較不同柱溫(30℃、35℃)、制樣采用不同稀釋倍數(shù)(未稀釋、稀釋5倍、稀釋10倍)，不同進(jìn)樣量(5、10 μL)時的色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱溫為30 ℃、稀釋倍數(shù)為5倍和進(jìn)樣量為5 μL時各峰分離度較好，特征性強，峰形較好，故確定柱溫為30 ℃、制樣稀釋倍數(shù)為5倍和進(jìn)樣量為5 μL。流動相考察： 通過考察1 mL·L-1甲酸-甲醇、1 mL·L-1磷酸-甲醇、1 mL·L-1甲酸-乙腈、1 mL·L-1磷酸-乙腈等流動相體系，比較各流動相組成條件下色譜圖中各組分基線狀況、峰形、分離度等，結(jié)果表明，用乙腈-1 mL·L-1磷酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，基線平穩(wěn)、色譜峰峰形良好、分離度高、譜圖信息較為豐富。

4.3 專屬性實驗

據(jù)文獻(xiàn)報道，新綠原酸、綠原酸、異槲皮苷主要來源于處方中的魚腥草和菊花[18,20]；咖啡酸、迷迭香酸主要來源于紫蘇葉、荊芥和蘆根[23,26-27]；紫蘇醛主要來源于紫蘇葉[23]；1,3-O-二咖啡酰奎寧酸、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸來源于菊花[18]；連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷來源于連翹[19]；甘草苷、甘草酸來源于甘草[21]；阿魏酸主要來源于蘆根和紫蘇葉[23,27]；橙皮苷、蒙花苷主要來源于薄荷和菊花[18,24]；槲皮素來自于菊花、桑葉和魚腥草[18,20,22]。將各成分制備成相應(yīng)的模擬制劑，依據(jù)供試品制備方法制成陰性對照溶液。結(jié)果顯示，各個陰性對照均無干擾，說明專屬性強。

總之，本實驗通過高效液相色譜法對四季抗病毒合劑中17種成分進(jìn)行了定量研究，制樣方法簡便，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性，可用于評價四季抗病毒合劑的質(zhì)量，也為四季抗病毒合劑臨床應(yīng)用提供了依據(jù)，為以后的藥代動力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。