氨茶堿對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重塑的影響

杜文秀，張 欣，劉 芳，杜俊鳳，張 穎，遲玉敏

滄州市中心醫(yī)院呼吸科，滄州 061000

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的主要病理特點(diǎn)為氣道反復(fù)炎癥、氣流阻塞和氣道重塑，其中氣道重塑是導(dǎo)致氣流受限的機(jī)制之一，而氣道炎癥所致氣道重塑為COPD發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]。轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子β1(trandforming growth factorβ1，TGF-β1)/Smads通路是與COPD氣道慢性炎癥、氣道重塑最相關(guān)的信號(hào)通路[2]。TGF-β1是前炎癥因子，有極強(qiáng)的致纖維化作用，在炎癥損傷、氣道重塑中扮演了重要角色；Smad2為其下游受體激酶，為TGF-β1信號(hào)輸出的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子[3]。氨茶堿為臨床常用的支氣管擴(kuò)張劑，有解痙、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用[4]。故本研究基于TGF-β1/Smads通路，探討氨茶堿對(duì)COPD大鼠癥狀的改善及對(duì)氣道重塑的影響，為氨茶堿臨床治療COPD提供更多理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RSE3020動(dòng)物肺功能儀器(北京貝蘭博科技有限公司)；Smart view凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Major Science公司)；Imge-pro plus 5.0醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(上海元奧儀器有限公司)。

1.2 試藥

紅族渠香煙(焦油13 mg，尼古丁1.1 mg，河南安陽卷煙廠)；脂多糖(美國(guó)Sigma公司)；氨茶堿片(浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格0.1 g·片-1，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021127)；TGF-β1/Smads通路激動(dòng)劑SRI-011381(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，美國(guó)Abmole Bioscience公司)。白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)，IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)，ELISA試劑盒(上海臻科生物科技有限公司)，兔抗大鼠核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)，磷酸化 NF-κB(p-NF-κB)，TGF-β1，Smad2，p-Smad2，GAPDH一抗(北京百奧萊博科技有限公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(上海古朵生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，55只，7周齡，體質(zhì)量260～270 g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010。排除呼吸系統(tǒng)疾病，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理學(xué)原則。

2 方法

2.1 造模、分組和干預(yù)

隨機(jī)取45只大鼠建立COPD模型[5]：自制45 cm×55 cm×60 cm熏箱，將大鼠置于其中，點(diǎn)燃香煙10 根，煙熏15 min，散煙5 min，上述步驟重復(fù)2次。每日煙熏1次，連續(xù)干預(yù)1個(gè)月。煙熏實(shí)驗(yàn)第1天、第15天，麻醉大鼠后快速注入100 μL脂多糖(1 mg·mL-1)至氣管。共40只造模成功。隨機(jī)分為激動(dòng)劑組、模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組，每組各10只。剩余10只大鼠作為正常組，在造模第1天、第15天注入等體積生理鹽水。

煙熏30 d后給藥：激動(dòng)劑組灌胃SRI-011381溶液(以DMSO配制成質(zhì)量濃度為30 mg·mL-1的溶液)，激動(dòng)劑+氨茶堿組灌胃質(zhì)量濃度為30 mg·mL-1的SRI-011381溶液和質(zhì)量濃度為24 mg·mL-1氨茶堿溶液(氨茶堿片研制成粉末，以生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為24 mg·mL-1的溶液)，氨茶堿組灌胃質(zhì)量濃度為24 mg·mL-1的氨茶堿溶液，模型組、正常組灌胃等體積生理鹽水，均按1 g體質(zhì)量灌胃0.01 mL計(jì)算。每日1次，連續(xù)干預(yù)30 d。

2.2 測(cè)定大鼠肺功能

干預(yù)結(jié)束當(dāng)天，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，仰臥位固定在操作臺(tái)上，在頸部取縱形2 cm長(zhǎng)切口，充分暴露氣管，在環(huán)狀軟骨上取“T”形切口，氣管插管。切開大鼠左胸，迅速將胸腔插管與動(dòng)物肺功能儀器壓力傳感器連接后插入胸膜腔。MedLab生物信號(hào)采集系統(tǒng)分析肺功能潮氣量(tidal volume，VT)、呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

2.3 ELISA檢測(cè)大鼠有關(guān)指標(biāo)水平

ELISA檢測(cè)大鼠血清IL-8、IL-1β和氣道平滑肌中TIMP-1、MMP-9水平。取腹主動(dòng)脈血6 mL，離心取上清，-20 ℃凍存待檢。取血后處死，剝離大鼠氣道平滑肌組織制備成勻漿，離心取上清。參考IL-8、IL-1β、TIMP-1、MMP-9 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行：在酶標(biāo)包被板上設(shè)置對(duì)照孔、樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔，上樣，溫育，洗滌，加酶標(biāo)試劑，顯色，終止。在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值，計(jì)算各樣本質(zhì)量濃度。

2.4 觀察大鼠肺部病理改變及測(cè)量支氣管平滑肌厚度

處死大鼠后，右心室注射肝素，生理鹽水沖洗肺組織，直至顏色潔白，將右肺中葉用體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定，另一部分肺組織液氮冷凍。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成4 μm薄片，進(jìn)行HE染色，鏡下觀察肺部病理學(xué)改變。隨機(jī)選取每只大鼠HE染色切片下相對(duì)完整的3個(gè)小氣道進(jìn)行圖像分析測(cè)量，測(cè)量支氣管平滑肌厚度。

2.5 檢測(cè)大鼠TGF-β1/Smads通路蛋白表達(dá)

取出液氮冷凍的肺組織，裂解后制備勻漿，離心取上清。Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度，取20 μg總蛋白上樣，用10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，分離目標(biāo)蛋白至PVDF膜上，用質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h。加兔抗大鼠NF-κB、p-NF-κB、TGF-β1、Smad2(1∶1 000)、p-Smad2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯影，Image J圖像分析軟件檢測(cè)條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠肺功能

與正常組比較，激動(dòng)劑組、模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組的VT、PEF水平較低(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較，模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組的VT、PEF水平較高(P<0.05)；與模型組比較，激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組的VT、PEF水平較高(P<0.05)；與激動(dòng)劑+氨茶堿組比較，氨茶堿組的VT、PEF水平較高(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠肺功能指標(biāo)

3.2 大鼠血清IL-8、IL-1β水平

與正常組比較，激動(dòng)劑組、模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組血清IL-8、IL-1β水平較高(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較，模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組血清IL-8、IL-1β水平較低(P<0.05)；與模型組比較，激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組血清IL-8、IL-1β水平較低(P<0.05)；與激動(dòng)劑+氨茶堿組比較，氨茶堿組血清IL-8、IL-1β水平較低(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠血清IL-8、IL-1β水平

3.3 氣道平滑肌中TIMP-1、MMP-9水平

與正常組比較，激動(dòng)劑組、模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組TIMP-1、MMP-9水平較高(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較，模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組TIMP-1、MMP-9水平較低(P<0.05)；與模型組比較，激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組TIMP-1、MMP-9水平較低(P<0.05)；與激動(dòng)劑+氨茶堿組比較，氨茶堿組TIMP-1、MMP-9水平較低(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠氣道平滑肌中TIMP-1、MMP-9水平

3.4 大鼠肺部病理學(xué)

抑制劑組、模型組氣道黏膜上皮脫落，皺襞增多，管壁大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，氣道壁增厚；抑制劑+氨茶堿組、氨茶堿組氣道黏膜上皮少量脫落，黏膜皺襞減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，肺泡壁輕度膨大、變薄，氣道壁改善。見圖1。

注：A.正常組；B.激動(dòng)劑組；C.模型組；D.激動(dòng)劑+氨茶堿組；E.氨茶堿組。

3.5 大鼠支氣管平滑肌厚度

與正常組比較，激動(dòng)劑組、模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組支氣管平滑肌厚度較大(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較，模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組支氣管平滑肌厚度較小(P<0.05)；與模型組比較，激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組支氣管平滑肌厚度較小(P<0.05)；與激動(dòng)劑+氨茶堿組比較，氨茶堿組支氣管平滑肌厚度較小(P<0.05)。見表4。

表4 大鼠支氣管平滑肌厚度

3.6 大鼠TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與正常組比較，激動(dòng)劑組、模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表達(dá)水平較高(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較，模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表達(dá)水平較低(P<0.05)；與模型組比較，激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表達(dá)水平較低(P<0.05)；與激動(dòng)劑+氨茶堿組比較，氨茶堿組p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表達(dá)水平較低(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 大鼠肺部TGF-β1/Smads通路相關(guān)蛋白表達(dá)

注：A.正常組；B.激動(dòng)劑組；C.模型組；D.激動(dòng)劑+氨茶堿組；E.氨茶堿組。

4 討論

目前，COPD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，故無治愈方法。抑制氣道重塑，改善氣流受限成為臨床治療的主要方向。氨茶堿在支氣管擴(kuò)張治療實(shí)踐中長(zhǎng)達(dá)半個(gè)世紀(jì)，但隨著吸入皮質(zhì)激素、β受體興奮劑等問世，氨茶堿日益被忽視[6]。但近期研究發(fā)現(xiàn)氨茶堿有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，長(zhǎng)期使用可降低氣道高反應(yīng)性，是當(dāng)前唯一具有支氣管擴(kuò)張、減輕炎癥雙重效應(yīng)的藥物[7]。故本實(shí)驗(yàn)選用氨茶堿治療COPD，并探討其作用于肺部及氣道的具體機(jī)制。

因肺功能測(cè)定可反映COPD患者氣流阻塞程度，有簡(jiǎn)單易測(cè)、可重復(fù)、無創(chuàng)等優(yōu)勢(shì)，是評(píng)估COPD的必測(cè)項(xiàng)目。VT是指機(jī)體靜息狀態(tài)每次呼出、吸入的氣量，PEF是指深吸氣后快速呼氣的最高呼氣流量，均可反映氣道通暢性[8]。結(jié)果顯示：氨茶堿組VT、PEF水平高于模型組，提示氨茶堿可有效改善COPD肺功能。炎性細(xì)胞是在COPD炎癥中的主要參與細(xì)胞，可產(chǎn)生IL-8、IL-1β等炎癥因子，破壞氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞，加劇炎癥反應(yīng)[9-10]。IL-8為中性粒細(xì)胞趨化因子，IL-1β為促炎細(xì)胞因子，由支氣管上皮細(xì)胞等分泌，均有多種生物學(xué)作用，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)B細(xì)胞增殖的主要因子，在COPD氣道炎癥中發(fā)揮重要作用[11-12]。結(jié)果提示，氨茶堿組IL-8、IL-1β水平低于模型組，提示氨茶堿可抑制COPD氣道炎癥。氣道炎癥是誘發(fā)氣道重塑的關(guān)鍵因素，可通過破壞MMPs/TIMPs動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡，使纖維蛋白、膠原等過度表達(dá)，造成細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致氣道壁增厚，即氣道重塑的直接體現(xiàn)。據(jù)WU L等[13]報(bào)道，炎癥因子可刺激、促進(jìn)MMP-9表達(dá)。蔡仁萍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB能特異性結(jié)合MMP和TIMP基因啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)MMP-9、TIMP-1表達(dá)，破壞氣道細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致氣道重塑。結(jié)果顯示，氨茶堿組氣道平滑肌中MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平低于模型組，氣道平滑肌厚度小于模型組；HE染色觀察肺部病理發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，氨茶堿組氣道黏膜上皮破壞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕微，共同表明氨茶堿可抑制氣道重塑，保護(hù)氣道結(jié)構(gòu)完整。

NF-κB是調(diào)節(jié)COPD氣道細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的樞紐蛋白，也是激活TGF-β1/Smad2通路的上級(jí)細(xì)胞因子[15-16]。QUAN Y等[17]報(bào)道，一般情況下，NF-κB以無活性形式存在于COPD氣道黏膜細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，但受到炎癥、煙霧等刺激后活化，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與TGF-β1活化因子-組織轉(zhuǎn)谷氨酰酶基因啟動(dòng)子結(jié)合，激活TGF-β1/Smads通路，增加IL-8、IL-1β等炎癥因子釋放，反過來可反饋性激活NF-κB/TGF-β1/Smad2通路，形成惡性循環(huán)。TGF-β1在COPD、肺纖維化等肺病中均表達(dá)上調(diào)，可刺激成纖維細(xì)胞增殖，促使其向肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，通過NF-κB、Smads等通路，影響降解基質(zhì)蛋白酶活性，促使氣道細(xì)胞外介質(zhì)合成、沉積，最終導(dǎo)致氣道重塑[18-20]。結(jié)果提示，激動(dòng)劑組、模型組、激動(dòng)劑+氨茶堿組、氨茶堿組大鼠p-NF-κB、TGF-β1、p-Smad2蛋白表達(dá)水平逐漸下調(diào)，提示氨茶堿可能通過下調(diào)NF-κB/TGF-β1/Smad2通路改善COPD大鼠肺功能以及肺部病理學(xué)。

綜上所述，氨茶堿可改善COPD癥狀，可能通過下調(diào)NF-κB/TGF-β1/Smad2通路實(shí)現(xiàn)。