氨茶堿對脂多糖誘導的慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的作用

劉 芳，杜文秀，張 欣，杜俊鳳，張 穎，遲玉敏

滄州市中心醫院呼吸科，滄州 061000

慢性阻塞性肺疾病(COPD)具有患病率高、病程遷延、反復發作急性加重等特點[1-2]。當前尚未具體明確其發病機制，考慮與炎癥反應、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化-抗氧化失衡等因素有關[3-4]。其中肺局部存在的氧化-抗氧化失衡是導致COPD患者肺組織出現一系列病理變化的始動因素。氨茶堿是一種常用支氣管舒張藥物，具有抑制炎癥反應、減輕氧化損傷和免疫調節等作用，可激活組蛋白去乙酰基酶活性，控制氣道平滑肌細胞增生、氣道重塑，減輕肺損傷[5]。本研究通過開展動物實驗，著重分析氨茶堿對脂多糖誘導COPD大鼠肺功能、氧化-抗氧化失衡的影響及機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

小動物肺功能儀(北京貝蘭博科技有限公司)，Mx3005P實時熒光定量分析儀(美國安捷倫科技公司)。

1.2 試藥

氨茶堿(浙江瑞新藥業股份有限公司)；紅旗渠香煙(河南安陽卷煙廠)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)試劑盒(美國Cayman公司)；白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(美國Trevigen公司)；兔抗大鼠Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)、核因子E2相關因子2(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO-1)一抗及山羊抗兔IgG二抗(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗動物

選取48只健康SD大鼠，清潔級，均為雄性。大鼠7周齡，體質量260～280 g，購自浙江大學醫學院附屬第一醫院，許可證號：SYXK(浙)2019-0012。試驗前在溫度(22±2) ℃、相對濕度55%、12 h光照環境中適應性喂養7 d。本研究經動物倫理委員會批準。

2 方法

2.1 模型制備及分組

48只大鼠中隨機取10只為A組，另38只建立COPD大鼠模型[6]：自制煙熏箱(60 cm×60 cm×70 cm)，大鼠放置在箱內熏煙，先點燃8支香煙，燃盡后再點燃8支，時間約30 min。周一至周五每日2次，周六、周日每日1次，共3個月。煙熏后首月末、次月末，腹腔注射麻醉大鼠，縱行切開頸部皮膚，氣管分離。以含200 μg脂多糖溶液0.2 mL緩慢注入氣道，當日不被動吸煙。建模成功標準：建模后大鼠出現躁動不安、咳嗽氣急、行動遲緩、精神萎靡、毛發枯黃、體質量減輕等癥狀。38只大鼠建模成功36只，采用隨機體質量排序法分為B組、C組和D組，各12只。A組在相同箱內作偽暴露，氣道注入生理鹽水中，10只大鼠均納入研究。

2.2 動物干預

建模成功后即刻給藥。將氨茶堿片1 200 mg溶解于50 mL生理鹽水中，配制成質量濃度10 mg·mL-1溶液。根據人與動物之間給藥劑量換算。氨茶堿成人臨床有效劑量為13 mg·kg-1，換算成大鼠劑量為80 mg·kg-1。C組、D組分別給予1.0、2.0倍臨床有效劑量，即80、160 mg·kg-1氨茶堿溶液灌胃。A組、B組以等體積生理鹽水灌胃。每日1次，治療3個月。

2.3 肺功能檢測及動物取材、處理

治療后24 h，大鼠腹腔注射麻醉，仰臥位固定在鼠板上。縱行切開頸部皮膚，暴露氣管。將一倒“T”型切口作于環狀軟骨下兩氣管環處，氣管插管。胸腔插管連接小動物肺功能儀壓力傳感器經肋間隙插入胸膜腔，檢測第0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)、用力肺活量(FVC)、潮氣量、跨肺壓。計算第0.3 s用力呼氣容積與用力肺活量的百分比[(FEV0.3/FVC)%]、動態肺順應性(潮氣量/跨肺壓)。檢測后麻醉未清醒前斷頭處死，開腹，取肺組織，分為5 份，其中1份置于-80 ℃冰箱中保存，3份置于液氮中保存，1份置于40 g·L-1多聚甲醛中固定。

2.4 SOD、MDA、GSH水平

取冰箱保存肺組織，經生理鹽水制備組織勻漿，以12 000 r·min-1離心5 min，半徑8 cm，取上清液。黃嘌呤氧化酶法檢測SOD，硫代巴比妥酸法檢測MDA，微量還原型谷胱甘肽試劑盒檢測GSH，按照試劑盒使用說明書操作，根據標本吸光度值獲得其對應水平值。

2.5 IL-8、TNF-α水平

采用酶聯免疫吸附法檢測。取1份液氮保存肺組織，冰浴，制備勻漿，離心，取上清液。按照IL-8、TNF-α試劑盒說明書操作，根據標本吸光度值獲得質量濃度值。

2.6 Keap1、Nrf2、HO-1 mRNA相對表達量

采用RT-PCR法檢測。取1份液氮保存肺組織，提取總RNA，檢測質量濃度。進一步逆轉錄成cDNA，進行RT-PCR反應。以Primer Premier 5設計目的基因、內參基因引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：Keap1：F：5′-CTTTGCCGACTTCCACCAA-3′，R：5′-CCGCGATTTATGAGGTCAGT-3′。Nrf2：F：5′-CCATGCCTTCTTCCACGAA-3′，R：5′-AGGGCCCATGGATTTCAGTT-3′。HO-1：F：5′-TGTGTGATGCCACCAGATTT-3′，R：5′-GCTTTTCACGATGACCGAGT-3′。β-actin：F：5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′，R：5′-GATCCTTACCACTCCTTGCGAG-3′。反應體系： Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物、下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL。反應條件：95 ℃預變性，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；72 ℃，30 s；72 ℃，10 min，40個循環。瓊脂糖凝膠電泳，計算Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA相對表達強度(2-△△CT)。

2.7 肺組織病理形態學

采用HE染色法檢測。取40 g·L-1多聚甲醛固定肺組織，磷酸鹽緩沖液浸泡10～12 h。脫水，石蠟包埋，切片厚4 μm。二甲苯透明，梯度酒精脫蠟。蘇木精、伊紅染色。梯度酒精脫蠟，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.8 Keap1、Nrf2、HO-1 蛋白相對表達量

采用蛋白質印跡法檢測。取1份液氮保存肺組織，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，制備勻漿，離心。二喹啉甲酸法行蛋白定量，加2×上樣緩沖液，沸水浴變性。100 g·L-1十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離，轉膜，加50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h。加兔抗大鼠Keap1、Nrf2、HO-1和β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃搖床，孵育過夜，洗膜。加二抗(1∶2 500)，室溫孵育2 h，洗膜。加ECL試劑，顯影曝光成像，觀察相應蛋白條帶灰度值。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 肺功能指標

FEV0.3、FEV0.3/FVC和肺順應性組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組FEV0.3、FEV0.3/FVC、肺順應性降低，B組

表1 各組肺功能指標對比

3.2 SOD、MDA和GSH水平

SOD、MDA和GSH水平組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組SOD水平降低，MDA、GSH水平升高，且SOD，B組

表2 各組SOD、MDA和GSH水平 (mg蛋白計,

3.3 IL-8和TNF-α水平

IL-8、TNF-α水平組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組IL-8、TNF-α水平升高，D組

表3 各組IL-8和TNF-α水平對比

3.4 肺組織病理形態學

HE染色顯示，A組肺泡腔結構完整，肺間質無炎性細胞浸潤，細支氣管無明顯分泌物。B組肺泡壁厚度增加，存在細支氣管滲出，肺間質及細支氣管周圍存在大量炎性細胞浸潤。與B組比較，C組、D組肺泡壁增厚、細支氣管滲出、炎性細胞浸潤等異常病理變化減輕，其中D組改善更顯著。見圖1。

圖1 各組肺組織病理形態學變化 (HE×200)

Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA相對表達量組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組Keap1 mRNA相對表達量升高，Nrf2、HO-1 mRNA相對表達量降低，且Keap1 mRNA相對表達量，D組

表4 各組Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA相對表達量對比

3.6 Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對表達量

Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對表達量組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與A組比較，B組、C組和D組Keap1蛋白相對表達量升高，Nrf2、HO-1蛋白相對表達量降低，且Keap1蛋白相對表達量，D組

圖2 各組Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達比較

表5 各組Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相對表達量對比

4 討論

COPD是一種常見肺部非特異性炎癥性疾病，主要特點為不完全可逆、進行性加重的氣流受限[7-8]。氧化-抗氧化失衡在COPD發生發展中發揮重要作用，可引發炎癥反應，導致抗蛋白酶失活，造成肺損傷[9]。因此，糾正患者體內氧化-抗氧化失衡，已成為治療COPD、減輕肺損傷的新途徑。現代醫學既往研究多傾向于緩解癥狀、預防及治療并發癥等方面，就氧化-抗氧化失衡作用分析較少[10]。

研究發現[11]，氨茶堿不僅能促進支氣管平滑肌舒張，還可抑制炎癥介質釋放，緩解氣道高反應性，興奮呼吸中樞，減輕肺功能損傷。還有報道顯示[12]，氨茶堿可降低低氧誘導的細胞內活性氧水平增高，緩解COPD急性加重期患者臨床癥狀，但其對氧化-抗氧化失衡影響及機制尚不明確。本研究表明，氨茶堿給藥后大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、肺順應性和SOD升高，MDA、GSH、IL-8和TNF-α水平降低，HE染色顯示肺組織病理形態學異常改變減輕，效果呈劑量依賴性，這提示氨茶堿可減輕COPD大鼠炎性反應，緩解肺功能損傷，改善氧化-抗氧化失衡。

Keap1-Nrf2/HO-1信號通路為近年來發現的可抵抗氧化刺激的防御性傳導通路，在維持體內抗氧化物與過氧化物平衡中具有重要意義[13-14]。其中Nrf2為機體調節抗氧化系統重要轉錄因子，在COPD發病機制中發揮對抗氧化應激保護作用[15-16]。Keap1為Nrf2調節關鍵因子，多與Nrf2結合分布在細胞漿內，易受相關自由基、化學物質刺激導致Keap1、Nrf2解離，Nrf2轉位進入細胞核，誘導HO-1等下游抗氧化蛋白表達，發揮抗氧化作用[17]。LI J等[18]發現，人參二醇可減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷，機制可能與調控Keap1-Nrf2/HO-1信號通路有關。研究發現[19]，機體出現氧化應激后，Keap1-Nrf2通路可被激活，調控下游抗氧化蛋白表達，減弱氧化應激程度，抑制炎性因子釋放。還有學者提出[20]，Keap1-Nrf2/HO-1信號通路激活可減輕戊四氮誘導的小鼠氧化應激損傷，維持氧化-抗氧化平衡。這些研究提示，Keap1-Nrf2/HO-1信號通路可能在COPD患者肺功能及氧化-抗氧化失衡調節中發揮作用。本研究結果顯示，氨茶堿給藥后大鼠Keap1 mRNA及蛋白相對表達量降低，Nrf2、HO-1mRNA及蛋白相對表達量升高，效果呈劑量依賴性，這提示氨茶堿可激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路，推測這是其發揮改善COPD大鼠肺功能及氧化-抗氧化失衡的重要作用機制之一。

綜上所述，氨茶堿可減輕脂多糖誘導的COPD大鼠肺功能損傷，改善氧化-抗氧化失衡，其作用機制可能與激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路有關。但本研究并未就其他通路進行分析，而氨茶堿發揮作用是經過多種途徑實現的，故今后仍需進一步深入研究。