用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接研究宣肺解熱顆粒治療COVID-19

張 雪，鄒俊波，張小飛，彭 磊，陳志澤，郭東艷，梁玉潔，張恩戶，史亞軍

陜西中醫(yī)藥大學藥學院，咸陽 712046

宣肺解熱方是江夏方艙1號處方，是主要用于控制新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)早期發(fā)熱癥狀的臨床驗方。本方以柴胡清透少陽半表之邪，桂枝散寒解肌、辟穢化濁、從外而解，共為君藥；黃芩清泄少陽半里之熱，芍藥斂陰和營，百部有益肺止咳之功效，可助君藥散邪，共為臣藥；黨參益氣扶正，半夏降逆和中，共為佐藥；生姜助柴胡祛邪、助半夏和胃、助桂枝解肌，大棗助參、草益氣并助柴胡、白芍和里營，姜、棗合用，又可調(diào)和營衛(wèi)，甘草益氣和中，調(diào)和諸藥為使。配合成方，共奏和解少陽、解肌退熱、調(diào)和營衛(wèi)之功。

1 方法

1.1 宣肺解熱顆粒的藥效成分及靶點信息庫構(gòu)建

由TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和batman(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)得到宣肺解熱顆粒中柴胡、黃芩、半夏、生姜、大棗、黨參、炙甘草、桂枝、白芍與百部10味中藥的性味歸經(jīng)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中以藥物口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，在Batman數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)中以分數(shù)大于20和P值0.05為篩選條件，得到宣肺解熱顆粒中各個藥材的潛在成分。

通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查詢其潛在成分的SMILES字符串，將其輸入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中預(yù)測靶點，從而得到宣肺解熱顆粒潛在成分的相關(guān)靶點。用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢上述得到的潛在活性化合物對應(yīng)的藥物蛋白靶點，并用Uniprot在線數(shù)據(jù)庫查詢每個蛋白靶點對應(yīng)的基因名，確定物種來源為“human”并建立數(shù)據(jù)集，用于后續(xù)分析。

1.2 冠狀病毒相關(guān)靶點的檢索

分別以“COVID-19”和“FEVER”為關(guān)鍵詞輸入GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和CTD數(shù)據(jù)庫(https://ctdbase.org/)，即得到COVID-19合并發(fā)熱的靶點信息。

用在線工具Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)將冠狀病毒靶點與發(fā)熱靶點進行交集，得到二者的共有靶點(即冠狀病毒-發(fā)熱共同靶點)。

將宣肺解熱顆粒潛在成分靶點與冠狀病毒-發(fā)熱共同靶點進行交集，得到二者的共有靶點(即藥物-疾病共同靶點)。將篩選出的共同靶點在已經(jīng)總結(jié)的各單味藥材成分-靶點數(shù)據(jù)中查找到對應(yīng)的化學成分及所屬藥材。

1.3 宣肺解熱顆粒治療COVID-19-FEVER關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

將宣肺解熱顆粒的共同靶點及其對應(yīng)成分一同導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1中，利用其軟件中Merge功能將篩選出的活性成分、潛在靶點及疾病靶點構(gòu)建一個成分-靶點-疾病三元綜合網(wǎng)絡(luò)，用Cytoscape的插件Network Analyzer對網(wǎng)絡(luò)特征進行進一步分析。

1.4 宣肺解熱顆粒治療COVID-19-FEVER潛在作用靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)

STRING蛋白相互作用在線分析數(shù)據(jù)庫(Version 11.0)是整合已知和待預(yù)測的蛋白-蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫，而且具備強大的可視化展示相互作用網(wǎng)絡(luò)體系的功能。進入頁面選擇“multiple proteins”條目，將上一步得到的潛在靶點名稱輸入，并選擇“Homo sapiens”進行下一步的檢索，將蛋白-蛋白相互作用結(jié)果(.tsv格式文件)下載并保存。將文件中的node1、node2信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，并對其網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)進行分析，以節(jié)點的Degree值反映其靶點大小，從而構(gòu)建獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 關(guān)鍵核心基因與基因組百科全書(KEGG)分析

用R語言對靶點蛋白進行生物功能及分子信號通路的富集分析，探究其靶點蛋白在生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellularcomponent，CC)以及分子功能(molecular function，MF)方面的作用機制。

1.6 分子對接

用Discovery Studio 4.0軟件進行分子對接。在宣肺解熱顆粒治療新型冠狀肺炎早期發(fā)熱靶點中選取核心靶點，借助PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)找出靶點score值排序靠前的靶點蛋白結(jié)構(gòu)，配體為該靶點所對應(yīng)的化合物，用Drugbank在線平臺找出核心靶點對應(yīng)的陽性藥物并在PubChem中下載陽性藥物和所對應(yīng)化合物的2D 結(jié)構(gòu)。將整理好的靶點蛋白3D結(jié)構(gòu)和對應(yīng)化合物及陽性藥物的2D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Discovery Studio，用DOCK ligand(libDock)進行分子對接，得到核心靶點蛋白和對應(yīng)化合物及陽性藥物的相互作用關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 宣肺解熱方成分及靶點的篩選

通過借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺，總共篩選出化合物450個，其中柴胡中的化合物59個，黃芩中的化合物55個，半夏中的化合物37個，生姜中的化合物72個，大棗中的化合物50個，黨參中的化合物71個，炙甘草中的化合物11個，桂枝中的化合物26個，白芍中的化合物28個，百部中的化合物41個。全面總結(jié)每種化合物對應(yīng)的靶點。最終宣肺解熱顆粒全方的候選靶基因共有1 947個。

2.2 冠狀病毒合并發(fā)熱相關(guān)靶點的檢索

通過Genecards數(shù)據(jù)庫搜集后，得到339個冠狀病毒的相關(guān)靶點，CTD數(shù)據(jù)庫搜集得到冠狀病毒相關(guān)的靶點1 208個，將2個數(shù)據(jù)庫找到的靶點合并，去除重復(fù)靶點，冠狀病毒的相關(guān)靶點有1 519個。通過Genecards數(shù)據(jù)庫搜集后，得到899個發(fā)熱的相關(guān)靶點，CTD數(shù)據(jù)庫搜集發(fā)熱相關(guān)的靶點899個，將2個數(shù)據(jù)庫找到的靶點合并去除重復(fù)靶點后發(fā)熱的相關(guān)靶點有1 446個，將其與冠狀病毒的1 519個靶點在Venny 2.1.0中映射篩選后，得出530個共同靶點。與宣肺解熱顆粒1 947個候選靶基因在Venny 2.1.0中映射篩選出309個共同靶點。見圖1。

圖1 活性成分作用靶點與疾病靶點維恩圖

2.3 宣肺解熱顆粒治療COVID-19-FEVER關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的共同靶點在已經(jīng)總結(jié)的各單味藥材成分-靶點-疾病數(shù)據(jù)中查找到對應(yīng)的成分及所屬藥材，共378個成分。將宣肺解熱顆粒的共同靶點及對應(yīng)成分導(dǎo)入Cytoscape3.2.1中，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，導(dǎo)出其相關(guān)的拓撲數(shù)據(jù)度值，見圖2。節(jié)點的平均度值為7.428，大于該平均度值的節(jié)點有167個，其中成分有84個，靶點有82個。

圖2 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 宣肺解熱顆粒靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

將宣肺解熱顆粒82個冠狀病毒合并發(fā)熱的相關(guān)靶點蛋白輸入至STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)。將分析得到的蛋白相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)結(jié)果(.tsv格式)導(dǎo)入到Cytoscape 3.2.1軟件中，得到其可視化的蛋白質(zhì)相互作用體系網(wǎng)絡(luò)，見圖3，該網(wǎng)絡(luò)共有82個節(jié)點、976條相互作用關(guān)系，平均度值為23.805，各節(jié)點分別代表潛在作用靶點對應(yīng)的蛋白，節(jié)點大小與顏色表示靶點蛋白的“Degree”值大小，節(jié)點越大、顏色越深，該靶點蛋白在網(wǎng)絡(luò)體系中的度值越大；節(jié)點間連線表示靶點蛋白間存在潛在的相互作用關(guān)系。從圖3可知，宣肺解熱顆粒對治療COVID-19合并發(fā)熱的靶標中Degree值排名前20的靶標為蛋白激酶(AKT1)、腫瘤蛋白P53(TP53)、白細胞介素6(IL6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子受體(EGFR)、前列腺素氧化環(huán)化酶2(PTGS2)、雌激素受體1(ESR1)、熱休克蛋白HSP90-α(HSP90AA1)、原癌基因c-fos(FOS)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS3)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、白細胞介素1β(IL1β)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)以及PPARG(過氧化物酶體增生激活受體γ)，認為這些核心作用靶點在網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用，即為較重要的靶點。

圖3 潛在作用靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)示意圖

2.5 宣肺解熱顆粒治療COVID-19-FEVER的潛在核心靶點基因富集分析

將上述得到的82個潛在核心靶點利用R語言的Cluster Profiler軟件包分別進行GO與KEGG富集分析，目的是從整體角度出發(fā)，從而系統(tǒng)研究宣肺解熱顆粒在對COVID-19-FEVER治療方面可能影響的生物功能及相關(guān)分子機制。前10條路徑見表1。由表1可知，可以看出治療可能與影響流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路及乙型肝炎等有關(guān)。這些路徑上的靶點如HSP90AA1、TP53、AKT1、BCL2、MMP9、FOS、RELA、TNF、JUN、MAPK14、IL6、CASP3和IL1B是同時作用于許多不同的路徑，見圖4和表2。通過Cluster Profiler包重建了圍棋交互網(wǎng)絡(luò)，此網(wǎng)絡(luò)反映這些圍棋術(shù)語之間的內(nèi)部關(guān)系，圓點顏色越紅形狀越大表示此路徑與該病理發(fā)展越明顯，見圖5。

表1 Kegg通路富集前10條路徑

表2 數(shù)字所表示的靶點

表2(續(xù)) 數(shù)字所表示的靶點

GO富集分析所得到的相關(guān)結(jié)果：(按照重要顯著程度選取排名前10的結(jié)果)Biological Process(GO-BP)結(jié)果提示，宣肺解熱顆粒治療COVID-19-FEVER與活性氧代謝過程、對脂多糖的反應(yīng)、對細菌源分子的反應(yīng)和活性氧的反應(yīng)等過程密切相關(guān)。Molecular Function(GO-MF)結(jié)果提示，治療可能與泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性和類固醇激素受體活性等功能密切相關(guān)。(GO-CC)結(jié)果提示，治療可能與膜筏、膜微域、膜區(qū)和細胞周期素依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等密切相關(guān)。結(jié)果見表3。

表3 GO富集分析BP、CC與MF前10條路徑

表3(續(xù)) GO富集分析BP、CC與MF前10條路徑

2.6 分子對接結(jié)果分析

為進一步說明靶點蛋白與對應(yīng)化合物之間的結(jié)合活性，本研究選擇宣肺解熱方治療COVID-19早期發(fā)熱中度值較高的4個核心靶點AR、SCN5A、ESR1和HSP90AA1，與其對應(yīng)的化合物進行分子對接，結(jié)合活性越高，得分越高，見表 4。其中β-谷甾醇與AR，β-谷甾醇與SCN5A，刺芒柄花素與ESR1,N-反式阿魏酰酪胺與HSP90AA1的結(jié)合活性最高。用Discovery Studio 4.0軟件進行陽性藥物驗證實驗和分子對接，并選擇與表4中對接得分最高的化合物即核心成分進行比較，對比情況見表5。核心靶點與核心成分、陽性藥物的對接結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，4個核心靶點與核心成分的對接得分均高于與陽性藥物的對接得分。

圖4 Kegg相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 核心靶點調(diào)控途徑網(wǎng)絡(luò)圖

表4 核心靶點與對應(yīng)化合物結(jié)合活性得分

3 討論

隨著COVID-19的全球流行和升級，中醫(yī)藥發(fā)揮了顯著療效，其對新型冠狀病毒感染者在疾病的預(yù)防治療、綜合治療和康復(fù)等取得了治療優(yōu)勢[1]。中醫(yī)理論認為COVID-19屬于“邪”范疇，其病機特點為“濕、毒、瘀、閉”，自古以來在防治新發(fā)傳染病方面都發(fā)揮著獨特作用[2-4]。中藥治療病毒感染性疾病不僅以清除體內(nèi)病原體為目的，而且能通過調(diào)動機體特異性和非特異性免疫功能增強抗病毒感染的能力[5]。而網(wǎng)絡(luò)藥理學能對“藥物-靶點-疾病”之間的相互關(guān)系進行系統(tǒng)地研究，已成為研究中藥作用機制的最有效的方法之一[6]。宣肺解熱方作為江夏方艙用于控制COVID-19早期發(fā)熱癥狀的臨床驗方，宣肺解熱方為小柴胡湯與桂枝湯的化裁方，其主要功效是和解少陽、解肌退熱、調(diào)和營衛(wèi)，治傷寒少陽證。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學借助多種生物信息學數(shù)據(jù)庫及 Cytoscape軟件等構(gòu)建了宣肺解熱方治療COVID-19-FEVER的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)以及蛋白-蛋白相互作用，并對關(guān)鍵節(jié)點以及通路進行了分析。通過以上的研究與分析，發(fā)現(xiàn)宣肺解熱方中中藥的化學成分主要集中在流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、HSP90AA1、TP53、AKT1、BCL2、MMP9、FOS、RELA、TNF、JUN、MAPK14、IL6、CASP3、IL1B與PTGS2等通路或靶點。

TP53也稱腫瘤抑制蛋白(P53)，其體細胞突變體的異位表達誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組變化，從而導(dǎo)致了炎癥反應(yīng)的異常激活[7]。HOLLA S等研究發(fā)現(xiàn)，肺泡Ⅱ型上皮細胞被BCG感染時，P53可通過抑制TNF-α介導(dǎo)細胞死亡[8]。王媛等研究發(fā)現(xiàn)，BCG感染A549細胞時, P53信號通路中的P53協(xié)同p300抑制NF-kB、TLR-4和TRAF6的活化及負調(diào)控TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的分泌,從而抵抗MTB的侵染[9]。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與包括代謝、增殖、細胞存活、生長等多種生物學過程[10]。IL6、IL1B屬于炎癥細胞因子，由巨噬細胞產(chǎn)生，參與免疫反應(yīng)的細胞增殖、分化并提高其功能[11]，其中《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案(試行第七版)》已將IL-6作為COVID-19病情惡化的臨床警示指標[12]，其編碼的蛋白質(zhì)被證明是一種內(nèi)源性熱原，能夠在自身免疫性疾病或感染患者中引起發(fā)熱[13]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是可以損傷腫瘤細胞并使其壞死的物質(zhì)，TNF-α是一種內(nèi)源性致熱源,可刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞及刺激巨噬細胞釋放炎性介質(zhì)，并且能進一步誘導(dǎo)IL-6等細胞因子的產(chǎn)生,這些促炎性細胞因子參與體內(nèi)急性反應(yīng)、發(fā)熱反應(yīng),引起趨化因子的釋放等,還可使內(nèi)皮細胞活化而導(dǎo)致血管通透性增加[14]。MMP家族參與調(diào)節(jié)一些與炎癥相關(guān)的分子，如生長因子、細胞因子和趨化因子，MMP9可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和炎癥細胞的分布介導(dǎo)炎癥相關(guān)疾病的發(fā)展[15]。PTGS2負責

表5 核心靶點與核心成分、陽性藥物的結(jié)合活性得分比較

注：A.谷甾醇；B.雙氫青蒿素；C.谷甾醇；D.卡馬西平；E.刺芒柄花素；F.己烯雌酚；G.反式阿魏酰酪胺；H. 4-(1,3-苯并二氧代L-5-基)-5-(5-乙基-2,4-二羥基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸。

前列腺素的產(chǎn)生，而前列腺素是導(dǎo)致發(fā)熱的重要介質(zhì)，因此這些化合物和靶點是宣肺解熱方發(fā)揮解熱作用的主要成分和靶點。

通過在TCMSP中的篩選發(fā)現(xiàn)，宣肺解熱方中含有黃芩素、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芍藥苷等化學成分，其中槲皮素、山柰酚等成分已被證明可能是治療COVID-19的關(guān)鍵性成分[16-18]。黃芩素是黃芩中含量最高的黃酮類，也是黃芩的主要活性成分。黃芩素對感染性疾病具有較好的防治作用，可發(fā)揮抗菌、抗病毒[19]、抗炎[20]、解熱等藥理活性。黃芩素可能是黃芩治療COVID-19的主要活性成分。黃芩素可與SARS-CoV-2 3CL水解酶對接，且具有較強的結(jié)合性，意味著黃芩素可能在抑制病毒復(fù)制上發(fā)揮潛在的作用[21]。槲皮素分子式為C15H10O7，是一種廣泛存在于自然界的植物次生代謝物，在體內(nèi)和體外都具有抗氧化作用[22]、調(diào)節(jié)炎癥[23]等作用。槲皮素也是一種植物源殺菌劑，具有較強的體內(nèi)外抑菌作用與廣譜抗菌性[24]，能抑制感染細胞Casepase-3蛋白的高表達,拮抗病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡,達到抗病毒作用[25]。芍藥苷(peoniflorin)是一種水溶性單萜類糖苷，具有解痙鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎、抗癌等藥理作用[26]。芍藥苷具有降低血清MDA含量，提高血清SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平，減少血清炎癥因子水平，改善肺組織病理改變，對MRL/lpr狼瘡小鼠肺損傷起到保護作用[27]。

GO和KEGG富集結(jié)果表明，宣肺解熱顆粒通過多種生物學過程和多條信號通路參與COVID-19早期發(fā)熱癥狀的治療過程。從GO富集分析結(jié)果可得知，共同靶點主要涉及生物學過程有活性氧代謝過程、對脂多糖的反應(yīng)、對細菌源分子的反應(yīng)和活性氧的反應(yīng)等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，宣肺解熱顆粒作用于COVID-19早期發(fā)熱癥狀的靶點主要涉及影響流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路及多種疾病等多條通路。其中與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路已被證實與COVID-19感染相關(guān)[28]。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路與血管損傷、炎癥反應(yīng)和動脈粥樣硬化密切相關(guān)，通路激活可導(dǎo)致活性氧過量產(chǎn)生、NF-κB活化、黏附分子和細胞因子表達增加[29]。

為進一步說明蛋白與相應(yīng)配體化合物的結(jié)合活性，結(jié)合文獻報道，在宣肺解熱方治療COVID-19早期發(fā)熱作用度值較大的靶點中選取4個核心靶點AR、SCN5A、ESR1和HSP90AA1，在Drugbank里找出與蛋白有關(guān)的4個陽性藥雙氫青蒿素、卡馬西平、己烯雌酚與4-(1,3-苯并二氧代l-5-基)-5-(5-乙基-2,4-二羥基苯基)-1H-吡唑-3-羧酸，配體即為該蛋白所對應(yīng)的成分。用Discovery Studio 4.0對該蛋白和配體及陽性藥進行分子對接，結(jié)果表明，該蛋白與配體的結(jié)合活性分數(shù)高于與陽性藥的結(jié)合活性分數(shù)，即蛋白與配體的結(jié)合活性較高。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析得到的宣肺解熱方中有效成分，明確具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用，并且能夠通過作用于相關(guān)的靶點對COVID-19早期發(fā)熱引發(fā)的機體代謝異常、炎癥反應(yīng)發(fā)揮潛在的治療作用，可為臨床上COVID-19的治療奠定一定的研究基礎(chǔ)。