潤肺寧神方治療新型冠狀病毒肺炎致失眠的網絡藥理學機制

梁玉潔，鄒俊波，張小飛，彭 磊，張 雪，陳志澤，郭東艷，楊艷君，周 曉，劉 琳，史亞軍*，雷根平

1.陜西中醫藥大學藥學院，咸陽 712046；2.陜西中醫大學附屬醫院，咸陽 712046

潤肺寧神方由當歸、生白芍、柴胡、茯神、炒白術、炙百部、合歡皮、川芎、酸棗仁、知母與炙甘草11種藥材組成，用于治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)引起的失眠。處方中當歸、甘草為君藥，具有抗抑郁、平喘[1-2]的功效；合歡皮、柴胡為臣藥，具有鎮靜催眠抗抑郁、抗失眠[3-4]的功效，酸棗仁養血安神、平肝理氣，善治虛煩不眠[5]。

本文通過網絡藥理學方法和分子對接技術對潤肺寧神方進行分析，并探討其治療COVID-19致失眠的機制，為其今后的治療提供參考。

1 方法

1.1 藥材成分靶點篩選

在TCMSP平臺(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)以類藥性(DL)和生物利用度(OB)作為篩選條件，檢索白術、柴胡、川芎、當歸、茯神、甘草、合歡皮、生白芍、酸棗仁、知母和炙百部的潛在成分和靶點信息，以Batman(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)和CTD(https://ctdbase.org/)數據庫作為補充，檢索藥材其余靶點信息。

1.2 疾病靶點篩選

以“Sleep Initiation and Maintenance Disorders”、“COVID-19”為關鍵詞在Disgenet、GeneCards、CTD和Malacards數據庫中(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET、https://www.genecards.org、https://ctdbase.org、https://www.malacards.org)搜索，在GeneCards數據庫中以Score≥5.04、CTD數據庫中以Score≥25.04為篩選條件，得到失眠相關的靶點信息，將3個數據庫搜集的靶點去重，得到失眠的相關基因。在CTD數據庫中以Score≥6為篩選條件，得到COVID-19相關靶點信息，將3個數據庫搜集的靶點去重，得到COVID-19的相關基因。

1.3 成分-靶點-疾病網絡構建

利用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)導入22個疾病刪去重復值的靶點，取交集，得到兩者共有靶點。導入藥材和2個疾病交集靶點，取交集，得到疾病和藥材共有靶點。在Excel表格中建立成分-靶點、疾病-靶點關系表，導入Cytoscape 3.2.1軟件，構建出成分-靶點-疾病網絡圖。

1.4 靶點相互作用網絡的構建

將Cytoscape篩選出的潛在靶點導入STRING網絡平臺上(https://string-db.org/)，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，構建蛋白相互作用(PPI)網絡圖。用Cytoscape 3.2.1軟件，導入蛋白相互作用.tsv文件，用度值篩選出潤肺寧神方治療失眠的核心靶點。

1.5 GO分析和KEGG通路富集

在R軟件平臺安裝Cluster Profiler軟件包，對核心靶點進行GO分析和KEGG通路富集分析，再利用R平臺構建交互網絡。

1.6 分子對接

在處方治療COVID-19致失眠的網絡圖中選取5個核心靶點，用PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)找出Score值靠前的靶點蛋白結構，配體是對應于靶點的化合物。在Drugbank平臺(https://go.drugbank.com/)找到靶點對應的陽性藥并在Pub Chem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載陽性藥物和靶點對應化合物的2D結構，將靶點3D結構、陽性藥2D結構和對應化合物導入Discovery Studio，用DOCK ligand(libDock)進行分子對接，得到靶點、陽性藥和化合物的相互關系圖。

2 結果與分析

2.1 藥材成分靶點篩選結果

根據數據庫的檢索結果得到潤肺寧神方中共有藥材成分349種，其中白術17種、柴胡17種、川芎11種、當歸120種、茯神5種、甘草92種、合歡皮15種、生白芍13種、酸棗仁12種、知母15種和炙百部32種。11種藥材去除重復值后包括靶點1 904個。

2.2 疾病靶點篩選結果

失眠靶點在Genecards數據庫中以Score≥5.04為條件找到相關靶點176個；在CTD數據庫中以Score≥25.04為條件找到相關靶點1 208個；Disgenet數據庫中找到15個，3個數據庫去除重復靶點后共有1 337個。COVID-19靶點在Genecards數據庫找到339個；在CTD數據庫中以Score≥6為條件找到相關靶點1 250個；在Malacards數據庫中找到10個，3個數據庫去除重復靶點后共有1 505個。將2個疾病靶點導入Venny 2.1.0作圖，共有交集靶點404個，見圖1，疾病與藥材交集250個，見圖2。

圖1 疾病與疾病之間的共同靶點

圖2 疾病與藥材之間的共同靶點

2.3 成分-靶點-藥材網絡構建分析

將成分-靶點、疾病-靶點關系表導入Cytoscape 3.2.1中，用Network Analyer計算出平均值為9.358，取平均值和最大值為區間，選出核心靶點構建成分-靶點-藥材網絡。網絡圖包括節點138個，邊線969條，見圖3。由圖3可知處方治療COVID-19致失眠為多成分、多靶點的聯合作用。

圖3 成分-靶點-藥材網絡

2.4 靶點相互作用網絡的構建分析

將藥材和疾病的共同靶點上傳至String中，Organism設置為Homo sapiens，得蛋白與蛋白相互作用PPI網絡，見圖4，該網絡有59個節點、671條相互作用關系，平均度值22.7。下載PPI網絡數據.tsv文件，將其導入Cytoscape 3.2.1中以Degree值排序，選出平均度值大于22.746的核心靶點33個，見圖5，節點越大表示其相關性越強、越重要。其中最為重要的有AKT1、INS、TP53、IL-6、JUN、CASP3、TNF、CAT、PTGS2和CXCL8等。

圖5 靶點與靶點相互關系

2.5 GO分析和KEGG通路富集分析

用R語言的Cluster Profiler軟件執行GO和KEGG，共富集并排列了2 430條路徑，其中KEGG有170條路徑，前10條路徑見表1。COVID-19致失眠病理發展與人類巨細胞病毒感染、流體剪切應力與動脈粥樣硬化及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等有關。見圖6和表2，可以了解到這些路徑上的靶點如ATK1、RELA、IL1B、CXCL8和CASP3等是同時作用于許多不同的路徑。通過Cluster Profiler軟件包構建圍棋交互網絡，該網絡反映了圍棋術語之間的關系，見圖7，圓點顏色越紅越大表示該路徑與病理發展越明顯。

表1 KEGG通路富集前10條路徑

圖6 疾病、藥材靶點的KEGG相互作用網絡

表2 數字所表示的靶點

圖7 核心靶點調控網絡

GO分析可分為細胞組分(cellularcomponent, CC)、分子功能(molecular function, MF)和生物過程(biological process, BP)3部分。GO分析結果在生物過程中富集2 114條路徑，在細胞組分中富集41條路徑，在分子功能上富集了105條路徑，表3列舉了前10條路徑。

表3 GO分析BP、CC、MF前10條路徑

表3(續) GO分析BP、CC、MF前10條路徑

2.6 分子對接分析

為進一步研究機制，選取網絡圖中度值排名靠前的5個核心靶點PTGS2、AR、PPARG、NOS2和HSP90AA1，并將靶點對應的化合物進行分子對接，得分越高表示其結合活性越高，結果見表4。其中PTGS2與β-谷甾醇、AR與1-甲氧基菜豆素、PPARG與1-甲氧基菜豆素、NOS2與3′-羥基-4′-O-甲基光甘草定以及HSP90AA1與脫水淫羊藿素結合活性高。用Discovery Studio進行陽性藥物驗證和分子對接，并選取表4中得分最高的化合物與陽性藥物比較，結果見表5。核心靶點與核心成分、陽性藥物的對接結果見圖8，可以看出，5個核心靶點與核心成分對接的得分結果均高于與陽性藥物的分數。

表4 核心靶點與對應化合物結合活性得分

表4(續) 核心靶點與對應化合物結合活性得分

表5 核心靶點與核心成分、陽性藥物的結合活性得分對比

注：A.PTGS2-塞來昔布；B.PTGS2-β-谷甾醇；C.AR-7-羥基-4-甲基-3-(2-羥基乙基)香豆素；D.AR-1-甲氧基菜豆素；E.PPARG-二十碳五烯酸；F.PPARG-1-甲氧基菜豆素；G.NOS2-瓜氨酸；H.NOS2-3′-羥基-4′-O-甲基光甘草定；I.HSP90AA1-格爾德霉素；J.HSP90AA1-脫水淫羊藿素。

3 討論

由新型冠狀病毒感染所致的COVID-19具有傳染性強、傳播迅速、死亡率高等特點，嚴重危害人類健康[6]。疫情爆發后，雷根平院長作為陜西援鄂抗疫中醫醫療隊隊長，在江夏方艙醫院開展抗疫工作，提出了分別針對COVID-19病人不同癥狀的江夏系列方，用過處方的大多數患者癥狀都有了顯著改善。

國際疾病分類第十版將失眠定義為睡眠啟動和維持障礙以及早醒[7]。中醫認為引起失眠的原因是陰衰陽盛、心脾肝腎氣血不足[8]。本研究通過網絡藥理學利用多種生物學信息庫以及Cytoscape軟件等構建了潤肺寧神方和失眠的成分-靶點-藥材網絡和靶點相互作用網絡，并對關鍵節點和重要通路進行富集分析。通過以上研究發現，潤肺寧神方成分主要集中在人類巨細胞病毒感染、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、AKT1、INS、TP53、IL6、JUN、CASP3、TNF、CAT、PTGS2和CXCL8等通路或靶點。

人類巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)與機體免疫功能和神經功能相關[9-10]，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)與血管損傷、炎癥反應和動脈粥樣硬化息息相關，通路激活可導致活性氧過量產生、NF-κB活化、黏附分子和細胞因子表達增加[11]，NF-κB可使IL-6和TNF-α釋放增加。ATK1是一組蛋白質合成信號靶蛋白，通過評估發現，AKT1可通過調節相關通路增加肌蛋白合成，恢復呼吸肌，還可抑制AKT磷?；?，減少支氣管平滑肌增殖，從而減輕氣道重塑[12-13]。ATK1參與代謝、增殖、生長以及血管的生成等過程的調節。研究表明AKT1多態性在漢族人抑郁癥、焦慮癥方面起重要作用[14]。研究發現，被流感病毒感染的肺部，致炎因子激活中性粒細胞和單核細胞，釋放TNF炎性細胞因子使機體發生炎性細胞反應和組織損傷。TNF可促進內皮細胞黏附因子的表達分泌并促使白細胞與之黏著，還能激活間質組織蛋白水解酶的釋放及中性粒細胞的聚集，從而發揮治療疾病作用[15]。TNF-α為參與炎癥過程的關鍵因子之一，參與機體免疫、炎癥反應、抗腫瘤、神經元調控等過程，是免疫和神經系統的連接信使，通過炎癥因子的釋放可以使免疫系統調節睡眠，失眠可導致體內TNF-α含量變高，通過調節體內TNF-α含量可以改善睡眠。IL-6是具有抗炎和促炎功能的細胞因子，在中樞神經系統的病理損害過程和促進大腦釋放神經生長因子上均發揮作用。IL-6在人體的分泌與睡眠規律一致，與睡眠的正常密切相關[16]。IL-6還可誘導T細胞分化，促進炎性誘導因子釋放，參與肺炎病理過程[17]。

為了進一步說明靶點蛋白與其配體化合物的結合活性，選取潤肺寧神方治療COVID-19致失眠網絡圖中度值前5個靶點PTGS2、AR、PPARG、NOS2與HSP90AA1。在DrugBank中找到靶點對應的5個陽性化合物塞來昔布、7-羥基-4-甲基-3-(2-羥基乙基)香豆素、二十碳五烯酸、瓜氨酸和格爾德霉素。靶點對應的成分化合物是該靶點的配體。分子對接結果表明蛋白與配體的結合活性高于陽性藥的得分。在這些核心靶點中，PTGS2參與前列腺素E2生產的重要過程，前列腺素E2在運動性調節、增殖、抗凋亡等方面發揮重要作用，可在炎癥因子的誘導下增加表達量。PPARG是過氧化物酶體增殖物激活受體亞家族的成員，該基因編碼的蛋白質參與免疫、炎癥等過程[18]。HSP90AA1蛋白在抑郁患者中表達增加[19]。作為一氧化氮合酶的NOS2表達異常時可使NO含量升高，啟動機體氧化應激，加重炎癥反應[20]。

有證據表明，山柰酚對急性肺損傷等炎性癥狀有潛在的治療作用[21]。山柰酚、槲皮素均有鎮靜、催眠作用[22-23]。槲皮素可以通過抑制炎癥因子的表達發揮抗炎作用，抑制TNF-α降低炎癥水平[24]。異鼠李素具有抗炎作用，可通過抑制TNF-α、IL-6發揮保護急性肺損傷的作用[25]。β-谷甾醇可抑制TNF-α的生成與釋放發揮抗炎作用[26]。β-谷甾醇可以順利透過血腦屏障，沉積于腦細胞膜上。還可通過增加去甲腎上腺素、5-羥色胺及其代謝產物改善抑郁癥狀[27]。

綜上所述，潤肺寧神方治療COVID-19致失眠的機制可能是通過槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇等化學成分作用于IL-6細胞因子、抑制TNF-α的釋放等。推測潤肺寧神方通過抑制IL-6、抑制TNF-α等發揮治療COVID-19致失眠的作用。預測了處方治療疾病的潛在靶點和生物過程及其機制。由于網絡藥理學的局限性，后期仍需對COVID-19致失眠及其相關治療藥物進行全面深入地研究。