尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠的制備及體外評價

王 慧，邵 青，張 燕，楊苗苗，胡婕雯，龔陽澤

西安市精神衛生中心，西安 710061

尼古丁[1-3]又名煙堿，是脂溶性物質，很容易通過人體的皮膚、黏膜組織吸收，適用于透皮給藥系統(transdermal delivery systems, TDS)。但其見光、遇熱易分解易揮發等性質在一定程度制約了其外用制劑的開發與應用[4]。

二元醇脂質體[5]是在乙醇的的基礎上加入無色黏稠的丙二醇，增加乙醇脂質體的穩定性，并改善乙醇易揮發及皮膚刺激性大的缺點。但二元醇脂質體為液態，經皮給藥不方便。溫敏凝膠[6]是受溫度影響而發生相變化的智能凝膠，膠凝溫度最接近人體皮膚溫度(32 ℃)，能較好地黏附于皮膚表面，延長藥物的作用時間。因此，本試驗制備尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠，并對其進行體外釋放評價，使藥物更易透皮吸收。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀系統(日本島津公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡有限公司)；藥物溶出儀(天津市精拓儀器科技有限公司)；高速離心機(湖南郝西儀器設備有限公司)；透皮擴散實驗儀(上海羅中科技發展有限公司)。

1.2 試藥

尼古丁(博騰藥業有限公司，質量分數>96%)；卵磷脂(PC上海愛康精細化工有限公司，質量分數90%)；羅丹明B、泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)均購自西格瑪奧德里奇有限公司；透析袋(截留相對分子質量為8 000～12 000，北京鵬成生物所分裝)；甲醇(色譜純，深圳立業實業有限公司)。

1.3 動物

昆明種小鼠(許可證號SCXK(甘)14-006，合格證：醫動字第14-006號，蘭州大學動物實驗中心)。

2 方法

2.1 含量測定

2.1.1色譜條件 Kromasil C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：三乙胺-甲醇-0.02 mol·L-1醋酸銨(0.1∶30∶60)，過濾(0.45 μm微孔濾膜)、脫氣；流速：1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為365 nm；進樣量為10 μL。

2.1.2標準曲線及線性范圍 精密稱取一定量尼古丁對照品，加甲醇溶液并定容，得對照品溶液。精密量取該對照品溶液，用甲醇將其稀釋成不同質量濃度的溶液(0.62、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00 μg·L-1)。按2.1.1項下色譜條件，進樣分析，以峰面積(A)對質量濃度(C)進行回歸，線性回歸方程A=87 345C+35 671，r=0.999 8，表明尼古丁在20～0.62 μg·L-1內與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.3精密度 精密量取尼古丁對照品溶液，用甲醇將其稀釋成高、中、低(20、10、5 μg·L-1)的質量濃度的對照品溶液，測日內精密度(5次)；測日間精密度(連續3 d)。結果，日內及日間RSD分別為2.11%、2.08%，表明該方法精密度良好。

2.1.4回收率 在5 mL量瓶中放入空白二元醇脂質體，加入用乙醇稀釋的0.62、5.00、20.00 μg·L-1尼古丁溶液，振蕩，離心5 min，進樣測定。計算樣品溶液的平均回收率為(99.70%±3.12%)，RSD為0.91%，表明該方法回收率良好。

2.2 制備尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠

2.2.1制備尼古丁二元醇脂質體 以包封率、透皮量及穩定性為考察因素[7]，預實驗結果顯示，當乙醇∶丙二醇為5∶5時，包封率最高，穩定性最好，透皮量最大。精密稱取處方量的尼古丁、磷脂PC和羅丹明B溶于4.5 mL上述醇溶液中(乙醇-丙二醇為1∶1)，將PBS(pH 6.5)5.5 mL 緩慢注入，整個過程在密閉恒溫容器中以700 r·min-1的轉速不斷攪拌20 min，制備過程中保持體系在(30±1) ℃，室溫冷卻30 min，過濾，得二元醇脂質體[8]。

2.2.2二元醇脂質體形態的測定 將制得的尼古丁二元醇脂質體樣品用共聚焦激光掃描電鏡觀察其形態[7]，顯示尼古丁二元醇脂質體均呈類球形或球形的囊泡。結果見圖1。

圖1 尼古丁二元醇脂質體熒光素共聚焦激光掃描圖

2.2.3尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠制備 冷溶法[9]制備溫敏凝膠。西林瓶中放入處方量的P188、P407，加入蒸餾水2.0 mL，放置24 h，使凝膠完全潤濕，得到無團塊的空白凝膠。冰水浴中放入P188/P407空白凝膠西林瓶，邊加熱邊攪拌，在攪拌中緩慢加入尼古丁二元醇脂質體3.0 mL，15 min后，制得P188/P407尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠。

2.3 膠凝溫度的測定

攪拌子法[10]測膠凝溫度。在塞西林瓶中放入磁攪拌子并加入適量尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠，水銀球浸沒在凝膠中，以500 r·min-1進行攪拌，緩慢升溫，當攪拌子完全靜止的溫度為膠凝溫度，連續測定3次。

2.4 尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠處方篩選

本實驗選用最接近人體皮膚溫度(32 ℃)為衡量凝膠的最重要指標。通過預實驗發現，對膠凝溫度影響較大的因素分別為藥物量、P188及P407的配比。

2.4.1藥物量對膠凝溫度的影響 實驗固定P188為凝膠量3.0%，P407為凝膠量30%，分別加入1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 的二元醇脂質體，研究藥物量對膠凝溫度的影響。結果見表1。

表1 不同含量藥物對膠凝溫度的影響

2.4.2P188對膠凝溫度的影響 實驗固定P407為凝膠質量分數的 30%，尼古丁二元醇3 mL，分別加入凝膠量2.6%、2.8%、3.0%、3.2%、3.4%的P188，制備溫敏凝膠并測定膠凝溫度。結果見表2。

表2 不同含量P188對膠凝溫度的影響

2.4.3P407對膠凝溫度的影響 實驗固定P188為凝膠量的 3.0%，尼古丁二元醇3 mL，分別加入質量分數26%、28%、30%、32%、34%的P407，制備溫敏凝膠并測定膠凝溫度。結果見表3。

表3 不同含量P407對膠凝溫度的影響

單因素結果顯示，當P188及P407含量一定時，膠凝溫度隨著尼古丁二元醇脂質體量的增加而升高，當尼古丁二元醇為3 mL時，此時的溫敏凝膠溫度為(32±0.70) ℃。當P407及藥物含量一定時，膠凝溫度隨著P188含量的升高而升高，當P188為3.0%時，此時的溫敏凝膠溫度為(32±0.50) ℃。當P188及藥物含量一定時，膠凝溫度隨著P407含量的升高而逐漸降低，當P407質量分數為30%時，此時的溫敏凝膠溫度為(32±0.90) ℃。三者都最接近人體溫度。

由表1至表3可見，溫敏凝膠的最優處方為尼古丁二元醇脂質體 3 mL、含3.0% P188及30% P407。按最優處方制備尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠，并測定其膠凝溫度(n=3)，結果平均凝膠溫度為(32±0.30) ℃。

2.5 尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠體外釋放評價

分別取含相同劑量尼古丁的體積分數為45%的乙醇溶液、二元醇脂質體及P188/P407二元醇脂質體溫敏凝膠，放入透析袋中，扎緊袋口，固定于槳上[11]，體積分數為45%的乙醇溶液作為接收液，在溫度為(32±1) ℃、轉速為100 r·min-1的釋放條件下，分別在規定的時間點(1、2、4、6、8、10、12、24 h)取1 mL接收液，及時補充同溫度同體積的接收液，樣品1 mL過濾，進樣10 μL，根據標準曲線得規定時間點的累計釋放百分比。結果見表4。

表4 尼古丁不同制劑體外累積釋放百分比

結果表明 ，尼古丁不同制劑在24 h內的藥物釋放情況，尼古丁二元醇脂質體在前3 h內藥物已經釋放接近100%，可見透析袋對游離藥物基本無阻礙作用。同樣的釋放條件下，尼古丁二元醇脂質體凝膠的藥物釋放比尼古丁二元醇脂質體有顯著的延緩作用，這可能是二元醇脂質體溫敏凝膠的藥物一部分包裹在囊泡中，一部分分散于凝膠網絡結構中，包裹于囊泡中的尼古丁先從囊泡中釋放到凝膠中，再從凝膠中緩慢釋放到介質中，減緩了藥物的釋放速度[12]，結果顯示二元醇脂質體溫敏凝膠有更好的緩釋作用。

2.6 小鼠皮膚二元醇脂質體及其溫敏凝膠分布

2.6.1給藥方法 羅丹明B與尼古丁均為脂溶性，故以羅丹明B代之。制備含有10 g·L-1羅丹明B的二元醇脂質體及二元醇脂質體溫敏凝膠，均勻涂抹于去毛的小鼠皮膚，12 h后，處死小鼠，剝離小鼠皮膚，放于載玻片，備用[12-13]。

2.6.2共聚焦激光掃描顯微鏡觀測 共聚焦激光掃描顯微鏡對載玻片上的備用皮膚進行斷層掃描 。結果見圖2。

由圖2可知，二元醇脂質體(A)及二元醇脂質體溫敏凝膠(B)均可攜帶藥物進入皮膚，圖A透皮深度比圖B強，但圖B皮內滯留量比圖A多，這可能是由于二元醇脂質體溫敏凝膠有更好的緩釋作用，在12 h體外釋放量僅為(35.3%±0.26%)，而二元醇脂質體此時釋放量(58.40%±0.25%)明顯高于二元醇脂質體溫敏凝膠。

圖2 含羅丹明B二元醇脂質體(A)和二元醇脂質體溫敏凝膠(B)的共聚焦激光掃描圖

2.7 二元醇脂質體溫敏凝膠穩定性及皮膚刺激性

2.7.1二元醇脂質體溫敏凝膠穩定性考察 將制備的二元醇脂質體溫敏凝膠分別置于冰箱(4 ℃)及室溫下，每月測定其膠凝溫度及尼古丁含量，不間斷測定3 個月[14-16]，在2 種貯存條件下，其膠凝溫度及尼古丁含量未發生明顯改變，表明二元醇脂質體溫敏凝膠穩定性良好[14-15]。結果見表5。

表5 3個月穩定性實驗結果

2.7.2二元醇脂質體溫敏凝膠皮膚刺激性考察 30只家兔，剪去背部皮膚，10只為對照組，另20只為實驗組[17-19]。實驗組兔脫毛的皮膚上涂抹固定劑量的二元醇脂質體溫敏凝膠。對照組當日處死，取背部皮膚，甲醛溶液(100 g·L-1)固定，脫水，HE染色，制成組織切片，顯微鏡下觀察。實驗組給藥后24、48 h，處死，取背部皮膚，同上處理后制成切片[20]，顯微鏡下觀察，與對照組相比，實驗組皮膚角質層無明顯增厚，基底層細胞并未液化變性，表明尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠對皮膚無刺激性，是安全可靠的經皮給藥制劑。結果見圖3。

注：A 對照組；B 涂抹凝膠后24 h實驗組；C 涂抹凝膠后48 h實驗組。

3 結論

本實驗以接近人體溫度(32 ℃)為考察指標，采用單因素實驗對處方進行優化，結果表明，尼古丁二元醇脂質體加入量、P188及P407比例分別為3 mL、3.0%及30%時，制備的尼古丁二元醇脂質體溫敏凝膠室溫下為液體，在體溫下為凝膠，易于給藥。體外累積釋放實驗及共聚焦激光掃描圖表明，制備的尼古丁二元醇脂質體凝膠具有明顯的緩釋作用，使藥物的作用時間明顯延長，大大增加了藥物的生物利用度。