烏魯木齊市某羊屠宰場沙門氏菌污染調查及分離株耐藥性檢測

曹婉怡，彭斌，朱亞磊，趙琴，王金泉

（新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

沙門氏菌是革蘭氏陰性兼性厭氧細菌，于19世紀首次分離出豬霍亂沙門氏菌（Salmonellasp.）[1]。作為人畜共患傳染病的主要傳染源之一，沙門氏菌傳播途徑多樣，經食物鏈可引起人和多種動物的急性或慢性傳染病[2]。肉制品作為沙門氏菌的攜帶體，屠宰加工時可通過操作人員、加工工具、運輸等途徑攜帶并傳播沙門氏菌[3]。

目前，沙門氏菌耐藥現象較為普遍[4]。Kroger等[5]對149株沙門氏菌進行10種以上的抗生素耐藥檢測，結果顯示，超過七成樣品存在不同程度的耐藥，其中超半數對兩種或兩種以上藥品敏感。在廣州地區進行非傷寒菌株耐藥性調查發現，氨芐西林的耐藥性最高，磺胺甲基異惡唑、頭孢他啶和環丙沙星也呈較高的耐藥性[6]，表明存在一定的安全隱患[7]。本研究以烏魯木齊某羊屠宰場為樣品采集地，對該地沙門氏菌的流行情況進行調查，并進行多種抗生素敏感試驗，以期為沙門氏菌的防控與治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2021年5月在烏魯木齊市某羊屠宰場采集112份樣品（57份羊胴體拭子、30份羊腸內容物、25份操作環境拭子）。無菌生理鹽水浸潤的棉簽涂抹羊胴體表面、操作工具及操作臺表面；刮取羊腸內容物后，立即放入提前準備好的甘油肉湯中并標記，24 h內送回待檢。

1.1.2 標準菌株

鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311，保存于新疆農業大學動物醫學學院畜產品質量安全實驗室。1.1.3試劑與儀器

主要試劑：營養瓊脂（NA）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎（TTB）、亞砷酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、MH肉湯、LB肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、0.1%煌綠溶液和碘溶液、PCR相關試劑均購自青島日水生物技術有限公司。

主要儀器：恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、基因擴增儀（PCR儀）、凝膠成像系統GELDOCXR（BIO-RAD公司）。

1.1.4 引物序列（見表1）

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

根據參考文獻確定inv A基因[8]并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.5 藥敏試驗材料

選取11種藥物的藥敏紙片，包括：β-內酰胺類：氨芐西林（AMP）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢曲松（CRO）；氨基糖苷類：卡那霉素（KAN）、慶大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）；喹諾酮類：環丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFX）；四環素類：四環素（TET）、酰胺醇類：氯霉素（CHL）；均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離純化

根據參考文獻[9]的方法操作。吸取2 mL含有樣品的甘油肉湯加入裝有2 mL BPW的滅菌離心管中，37 °C培養箱中培養24 h。培養后的樣品進行分裝處理，取1 mL培養液加入10 mL TTB（加入0.1%煌綠溶液、碘溶液，每100 mL/支）內，再取1 mL培養液加入10 mL SC內。將兩種增菌液做好標記均放入37℃培養箱內振蕩培養24 h。取出培養后的菌液，采用滅菌后的接種環蘸取菌液一環，分別在XLD和BS平板上，使用平板劃線法涂布，分別放入37和42℃環境中培養24、48 h；重復前一步驟3～4次，即得到理想菌落。

1.2.2inv-APCR鑒定

使用水煮法[10]提取模板；反應結束后，將與預期片段大小一致的產物進行測序、比對。

PCR擴增體系：2×Taq PCR Master mix 10 μL、inv AF 1 μL、inv A-R1 μL、超純水11 μL、模板2 μL。

PCR擴增條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環；72℃再延伸10 min。

1.2.3 保菌

陽性菌復蘇培養，取單一菌落進行純培養，使用60%甘油以1∶1比例將陽性菌制成甘油菌，-20℃保存。

1.2.4 藥敏試驗

使用上述藥物對陽性分離株采用紙片擴散法進行藥敏試驗。采用滅菌棉拭子蘸取復蘇后的菌液，均勻涂布于營養瓊脂平板；依次放置藥敏片，紙片之間距離為2 cm，37℃培養24 h，以標準菌株作為質控菌株并做2個平行重復，測量抑菌圈直徑以便判斷結果。結果表現依據標準[11]進行判定，分為耐藥（resistance，R）、中介（intermediary，I）及敏感（sensitive，S）。

2 結果與分析

2.1 分離純化結果（見圖1）

由圖1可知，37℃培養24 h后，沙門氏菌在XLD培養基上的菌落形態為粉紅色并帶有黑色中心的菌落；經42℃培養48 h后，BS培養基上的菌落形態為黑色有金屬光澤的菌落。

圖1 分離純化結果Fig.1 Separation and purification results

2.2 invA PCR鑒定結果（見圖2）

由圖2可知，使用PCR法對疑似分離株進行inv A特異性基因鑒定，有20株片段與預期大小一致，約284 bp。

圖2 部分樣品invA基因擴增鑒定結果Fig.2 PCR analysis of inv A gene in some samples

對上述產物進行測序并將結果在NCBI比對，結果顯示，有16株與GenBank上沙門氏菌序列同源性達99%以上，確定為沙門氏菌。

2.3 沙門氏菌分離鑒定結果

對在屠宰場采集的112份樣品，采用傳統培養基培養和PCR鑒定相結合的方法，共分離鑒定得到16株沙門氏菌，總陽性率為14.29%（16/112）。

其中，羊酮體陽性率12.28%（7/57）、羊腸內容物陽性率13.33%（4/30）、操作環境拭子陽性率20.00%（5/25）。

2.4 沙門氏菌藥敏試驗結果（見表2）

由表2可知，16株菌株對氨芐西林（68.75%）、頭孢噻肟（100.00%）和頭孢曲松（100.00%）表現高度耐藥；對氯霉素、四環素、諾氟沙星中介率較高，分別為62.50%、56.25%、56.25%；對氧氟沙星敏感率最高，但僅為37.50%。

表2 沙門氏菌藥敏試驗結果Tab.2 Salmonella susceptibility test results

3 討論

由沙門氏菌引起的群體性食源性疾病愈發受到重視，已被世界衛生組織認定為最常見食源性疾病病源之一[12]。人與動物的直接接觸可能在一定程度上促進耐藥菌株在宿主之間的迅速傳播，能夠密切接觸到耐藥菌株的人相對存在更大程度上被感染的風險[13]。抗生素的使用是耐藥基因傳播的關鍵因素。在動物性食品產業鏈中，抗生素一直作為治療劑、預防性藥物以及生長促進劑普遍應用，在一定程度上加劇了耐藥菌的傳播[14]。

國家疾病預防控制中心在2001年對生肉等7大類中國食品致病菌的調查中發現，生肉中沙門氏菌的平均污染率為9.35%[15]。本試驗對烏魯木齊某羊屠宰場112份樣品進行沙門氏菌檢測，結果顯示，16份樣本顯示陽性，檢出率為14.29%。不同研究中沙門氏菌檢出率的差異性，可能受調查對象不同、采樣季節變化、屠宰衛生條件、運輸銷售、分離方法等因素影響。因此，烏魯木齊市食源性沙門氏菌的污染情況不容忽視，應加強監督管理。

大量研究表明，肉制品產業鏈中存在耐藥性細菌[16]，抗生素的使用是引起耐藥菌出現的關鍵因素。因此，本研究對該屠宰場分離到的16株沙門氏菌進行11種抗生素的耐藥性檢測，結果顯示，16株分離株均表現敏感，其中對β-內酰胺類表現為高度耐藥，且對頭孢噻肟、頭孢曲松高達100%，可能是由于在養殖過程中β-內酰胺類藥物主要用于預防治療其他疾病有關。

羊源沙門氏菌通過食物鏈傳播，耐藥菌極易再傳播，不僅影響畜牧業發展，還會威脅人類健康，抗生素類藥物的規范使用迫在眉睫。故應當加強對耐藥菌的監督和檢測，以便積極應對沙門氏菌耐藥性問題。

4 結論

本研究結果表明，該屠宰場中存在沙門氏菌污染現象，并且存在不同程度上的耐藥現象。因此，需加強屠宰加工環節的管控措施，加大管理力度，完善場內消毒的方法并提高消毒頻次，以降低沙門氏菌的污染概率；同時還應規范養殖過程中抗生素藥物的使用，從源頭控制藥物耐藥性問題。