高壓微射流均質法制備二十二碳六烯酸藻油脂質體及其性質分析

李 暢，薛 璐，蘆 晶，逄曉陽，張書文，呂加平,*

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一種長鏈多不飽和脂肪酸。研究表明，DHA具有預防心血管疾病、促進大腦發育、緩解阿爾茨海默病等多種生理功能。相比于DHA魚油，DHA藻油受到的污染少、魚腥味弱、資源更加豐富，且研究發現DHA藻油食用更加安全，藻類中的DHA很少引起胃腸道不適。然而，DHA不飽和度高，容易受到光、熱、氧等不同因素的影響，極易氧化產生氫過氧化物，失去其功能活性及營養價值，這種不穩定性限制了其應用范圍。

脂質體是由脂類兩親性物質如磷脂組成的具有類細胞膜結構的一種閉合類球狀囊泡，由一層或多層磷脂包裹而成。最早是在1965年由英國科學家Bangham等發現，而后迅速發展成為一種運載體系。將DHA藻油制備成脂質體不僅對DHA能夠起到保護作用，且與微米級載體相比，納米級載體提供了更大的表面積、更好的擴散滲透性，還具有靶向性、長效性等特點。此外，由于被包封后發揮特定作用所需的藥物量要比未包封時少，因此可以屏蔽不良味道，大幅提高被包封物質的生物利用度及感官可接受性。脂質體的制備方法多樣，其中，高壓微射流均質技術近年來不斷發展并得以應用，利用這項技術制備的脂質體具有粒徑小、分散性均勻、避免使用有毒有機試劑、可實現商業化生產等優勢。目前高壓微射流均質技術已實現了對高油酸棕櫚油、酶制劑、蝦油等營養或功能物質的包埋，提高了這些物質的利用率。

近年來，隨著對脂質體包埋脂溶性物質相關研究的不斷深入，DHA脂質體相關的研究也逐步展開。Rasti等通過薄膜分散法將-3多不飽和脂肪酸包埋進脂質體，并將其與未包埋的魚油分別添加進食品，通過考察保留率、過氧化值等指標，證明了脂質體的穩定性與適用性。Han Chenlu等利用薄膜分散-超聲法制備得到DHA脂質體，通過體內及體外消化實驗，證實了脂質體這一運載形式可提高小腸對DHA的吸收。基于此，本研究采用薄膜分散與高壓微射流均質技術結合的方法，以DHA藻油脂質體的平均粒徑、包封率為主要評價指標進行DHA藻油脂質體制備的單因素試驗及響應面優化試驗，并考察DHA藻油脂質體物理穩定性、貯藏穩定性及氧化穩定性，旨在開發一種低粒徑、較高載量、穩定性好的脂質體運載體系，以便DHA藻油在藥品、食品實際加工生產中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DHA藻油（DHA純度≥40%） 廈門匯盛生物有限公司；大豆磷脂（磷脂酰膽堿純度≥45%） 上海麥克林生化科技有限公司；膽固醇、吐溫-80 國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BSA124S-CW電子天平 德國Sartorius公司；MVS-1渦旋混合器 北京金北德工貿有限公司；RE 52-05真空旋轉蒸發儀 上海亞榮生化有限公司；AMH-3高壓微射流均質機 安拓思納米技術（蘇州）有限公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司；U-3010UV紫外-可見分光光度計TEM-7500透射電子顯微鏡 日本日立公司；DSC 8000差示掃描量熱儀 美國PE公司；Turbiscan穩定性分析儀法國Formulaction公司；ZDJ-4A自動電位滴定儀 上海雷磁股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DHA藻油脂質體的制備

將一定量的大豆磷脂、膽固醇、DHA藻油脂溶性物質加入到適量無水乙醇中，用磁力攪拌器攪拌均勻，在45 ℃、真空條件下旋轉蒸發除去無水乙醇形成薄膜，將吐溫-80加入到0.01 mol/L、pH 7.2的PBS中攪拌均勻，再將PBS倒入裝有薄膜容器中振蕩水合得到脂質體，用高壓微射流均質機在一定壓力下處理若干次得到DHA藻油脂質體。

1.3.2 單因素試驗

設置大豆磷脂與膽固醇的質量比為6∶1，大豆磷脂與DHA藻油的質量比為8∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質量的15%，PBS（0.01 mol/L，后同）的pH值為7.2，高壓微射流均質壓力為120 MPa，均質次數為3，考察磷脂質量濃度在5、10、20、30、40 mg/mL條件下對DHA藻油脂質體包封率和平均粒徑的影響。

設置大豆磷脂質量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與DHA藻油的質量比為8∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質量的15%，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質壓力為120 MPa，均質次數為3，考察大豆磷脂與膽固醇的質量比在4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1條件下對DHA藻油脂質體包封率和平均粒徑的影響。

設置大豆磷脂質量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與膽固醇的質量比為6∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質量的15%，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質壓力為120 MPa，均質次數為3，考察大豆磷脂與DHA藻油的質量比在4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、20∶1條件下對DHA藻油脂質體包封率和平均粒徑的影響。

設置大豆磷脂質量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與膽固醇的質量比為6∶1，大豆磷脂與DHA藻油的質量比為8∶1，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質壓力為120 MPa，均質次數為3，考察吐溫-80用量占大豆磷脂質量0%、5%、10%、15%、20%條件下對DHA藻油脂質體包封率和平均粒徑的影響。

設置大豆磷脂質量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與膽固醇的質量比為6∶1，大豆磷脂與DHA藻油的質量比為8∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質量的15%，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質次數為3，考察均質壓力在0、80、100、120、140、160 MPa條件下對DHA藻油脂質體包封率和平均粒徑的影響。

設置大豆磷脂質量濃度為20 mg/mL，大豆磷脂與膽固醇的質量比為6∶1，大豆磷脂與DHA藻油質量比為8∶1，吐溫-80用量占大豆磷脂質量的15%，PBS的pH值為7.2，高壓微射流均質壓力為120 MPa，考察均質1、2、3、4、5、6 次對DHA藻油脂質體包封率和平均粒徑的影響。

1.3.3 響應面優化試驗及驗證實驗

在單因素實驗基礎上，利用Design Expert軟件進行響應面試驗的設計與分析。以平均粒徑為響應值，采用Box-Behnken Design選定三因素三水平進行試驗，試驗設計見表1。在得到的DHA藻油脂質體最優制備工藝條件下進行3 次實驗驗證，并在4 ℃條件下保存樣品。

表1 響應面試驗因素及水平Table1 Codes and levels of independent variables used in response surface design

1.3.4 DHA藻油脂質體性質表征

1.3.4.1 平均粒徑、多分散指數的測定

使用Zetasizer Nano ZS納米粒度分析儀分別測定平均粒徑、多分散指數（polydispersity index，PDI），用蒸餾水將DHA藻油脂質體稀釋至合適的質量濃度，平行測定3 次取平均值。

1.3.4.2 包封率的測定

DHA藻油-正己烷溶液標準曲線的繪制：精確稱取1 000.0 mg的DHA藻油溶于正己烷，在100 mL容量瓶中定容得到10.0 mg/mL的標準溶液，配制一系列不同質量濃度的DHA藻油-正己烷溶液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），以正己烷為空白，在288 nm波長處測定吸光度，以DHA藻油的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

采用有機溶劑萃取法并稍作修改以對DHA藻油脂質體的包封率進行測定。取1 mL脂質體于離心管中，加入4 mL正己烷，渦旋混合2 min后機械振蕩10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液在288 nm波長處測定吸光度。根據DHA藻油-正己烷溶液標準曲線計算游離DHA藻油的質量，實驗重復3 次取平均值。通過下式計算包封率。

式中：為未被包封進脂質體中的游離DHA藻油的質量/g；為制備脂質體時加入的DHA藻油質量/g。

1.3.4.3 微觀形態觀察

采用透射電子顯微鏡對經高壓微射流均質處理的脂質體（以下簡稱MF-L）及未經高壓微射流均質處理的脂質體（以下簡稱C-L）的微觀形態進行觀察。參照Chaves等的方法并稍作修改，將脂質體稀釋適當倍數至半透明狀態，用飽和的醋酸鈾酰負染色法制備觀測樣品。

1.3.4.4 差示掃描量熱分析

用差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法對MF-L及C-L相變溫度進行測定。參照Wang Qianqian等的方法并稍作修改，以空鋁鍋作為參照，平均樣品質量為（10±5）mg，在密封鋁鍋中加熱，溫度范圍為20～170 ℃，氮氣流速為20 mL/min，加熱速率為10 ℃/min。

1.3.5 穩定性分析

1.3.5.1 物理穩定性

利用Turbiscan穩定性分析儀對兩種DHA藻油脂質體的物理穩定性進行快速分析。取20 mL樣品于樣品瓶中，溫度設定為25 ℃，每1 h掃描一次，掃描24 h，記錄穩定性指數（turbiscan stability index，TSI）。

1.3.5.2 貯藏穩定性

將新鮮制備的兩種DHA藻油脂質體分別貯藏在4、25 ℃條件下，于第0、28天分別對平均粒徑、包封率進行測定。

1.3.5.3 氧化穩定性

將新鮮制備的兩種DHA藻油脂質體分別貯藏在4、25 ℃條件下，于第0、7、14、21、28天采用GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中的電位滴定法對過氧化值進行測定。

1.4 數據處理與分析

實驗數據用平均值±標準差表示，并通過SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析，以＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1A可知，隨著大豆磷脂質量濃度的增大，平均粒徑逐漸增大，包封率先升高后降低。低磷脂質量濃度下雖然粒徑更小，但包封效果不理想。高磷脂質量濃度雖然可以提高包封率，但過高的磷脂質量濃度容易使體系不穩定，產生絮沉，導致粒徑和PDI受到影響。綜合考慮，選擇20 mg/mL的大豆磷脂質量濃度進行后續實驗。

如圖1B所示，隨著大豆磷脂與藻油質量比的增加，平均粒徑總體呈增大趨勢，對包封率總體無明顯影響。當磷脂與藻油質量比為20∶1時，脂質體的雙層膜受到破壞，包封率減小至（80.6±11.5）%，原因可能與制備過程有關，當磷脂含量較多時，在旋蒸過程中很難形成均一穩定的薄膜，導致水合時磷脂析出。考慮到載藥量，磷脂與藻油的質量比選擇4∶1。

膽固醇是許多生物膜的主成分，對于脂質體的作用主要是通過自身的親水、親油基團增加雙層膜的剛性、厚度以及結構的有序性。如圖1C所示，隨著磷脂與膽固醇質量比的增加，平均粒徑逐漸減小，包封率逐漸增加。當磷脂與膽固醇質量比為8∶1時，平均粒徑最小，包封率達到最高。

吐溫-80的加入可提高脂質體的包封率。吐溫-80通過物理吸附在脂質體雙層膜表面，形成一定厚度的親水相，使脂質體在體系中更加均勻、穩定，并且在制備過程中有利于脂質體的水化。如圖1D所示，當不添加吐溫-80時，包封率最低，平均粒徑最大。隨著吐溫-80用量的增加，平均粒徑逐漸減小，包封率明顯增加。但加入過多的表面活性劑可能溶解脂質體囊泡，對脂質體具有破壞作用，故選擇吐溫-80用量20%進行后續實驗。

如圖1E所示，在高壓微射流均質技術處理粗脂質體的過程中，隨著均質壓力的增大，脂質體平均粒徑逐漸減小，相比未經該技術處理的脂質體，其包封率明顯增加。但在140 MPa均質壓力下，脂質體的微囊發生破裂，藻油發生泄漏，包封率降低，這與邰克東等的結論相似。當高壓微射流均質壓力為120 MPa時，脂質體的平均粒徑為（74.93±0.61）nm，包封率為（94.2±0.8）%，較為理想，故選擇高壓微射流均質壓力120 MPa進行后續實驗。

圖1F中，隨著均質次數的增加，脂質體的平均粒徑逐漸減小，包封率逐漸增大，均質處理5～6 次對于平均粒徑無明顯影響。但脂質體囊泡易因均質次數的增加或時間的延長而導致溫度升高，體系內容易出現重新聚集現象，故選擇均質處理次數5 次。

圖1 大豆磷脂質量濃度（A）、磷脂與DHA藻油質量比（B）、磷脂與膽固醇質量比（C）、吐溫-80用量（D）、高壓微射流均質壓力（E）、高壓微射流均質次數（F）對DHA藻油脂質體平均粒徑、包封率的影響Fig. 1 Effects of soy lecithin concentration (A), lecithin to DHA-rich algae oil mass ratio (B), lecithin to cholesterol mass ratio (C), Tween-80 dosage (D), homogenization pressure (E), and number of homogenization cycles (F) on mean particle size and encapsulation efficiency of DHA-rich algae oil liposomes

2.2 響應面優化試驗及驗證實驗結果

在單因素試驗的基礎上，以平均粒徑為響應值，選擇磷脂與膽固醇質量比、吐溫-80用量、高壓微射流均質壓力作三因素三水平響應面優化試驗，實驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Box-Behnken design with response variable

對上述試驗結果進行回歸擬合分析，得到以平均粒徑（）為因變量，磷脂與膽固醇質量比（）、吐溫-80用量（）、高壓微射流均質壓力（）為自變量的二次多項回歸方程：＝91.39+14.40-5.92-7.40-0.787 5+5.90+3.39-1.45-11.64-9.18。

方差分析結果見表3，模型＝0.001 3＜0.01，表明模型極顯著。失擬項＝0.217 0＞0.05，差異不顯著，同時模型決定系數＝0.978 0，說明該模型與實際情況擬合程度很好，可用于制備DHA藻油脂質體工藝優化的分析及預測。從分析結果中可知，、、對響應值影響極顯著，與影響極顯著，的交互作用影響顯著，交互作用響應面3D圖見圖2。其他因素及其相互作用對響應值的影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

圖2 磷脂與膽固醇質量比、均質壓力交互作用對DHA藻油脂質體平均粒徑的影響Fig. 2 Response surface plot showing interactive effect of soy lecithin to cholesterol mass ratio and homogenization pressure on mean particle size of DHA-rich algae oil liposomes

根據上述方程可計算最佳制備工藝：磷脂與膽固醇質量比11.9∶1、吐溫-80用量15%、高壓微射流均質壓力138 MPa，平均粒徑理論預測值為55.50 nm，使用優化后的工藝制備DHA藻油脂質體并進行驗證實驗，得到平均粒徑為（59.35±3.05）nm，PDI為0.189±0.025，包封率為（94.2±2.9）%。由此可見，利用Box-Behnken試驗設計建立的響應曲面模型優化可行。與黃茜等通過薄膜分散單一方法制備得到的DHA藻油脂質體以及涂宗財等通過乙醇注入法結合動態高壓微射流法制備得到的魚油脂質體相比，本研究中制備所得DHA藻油脂質體的平均粒徑、包封率更為理想，說明薄膜分散結合高壓微射流均質法的使用有效提高了脂質體的性能。

2.3 DHA藻油脂質體的表征

2.3.1 微觀結構

通過透射電子顯微鏡觀察到的MF-L與C-L大小、形態等信息如圖3所示，MF-L幾乎呈球體，分布均勻，與平均粒徑測定的結果一致。相比之下，C-L囊泡更大，部分粒徑接近1 μm，且均勻性較差。

圖3 MF-L放大倍數為60 000×（A）、200 000×（B）和C-L放大倍數為20 000×（C）、12 000×（D）的透射電子顯微鏡圖Fig. 3 TEM images of MF-L at 60 000 × (A), 200 000 × (B) and C-L at 20 000 × (C), 12 000 × (D) magnifications

2.3.2 DSC分析結果

通過DSC分析儀對兩種脂質體進行相變溫度的分析。圖4中與C-L相比，MF-L提高了相變溫度，峰值溫度由95.49 ℃提高到111.67 ℃，并且具有更小的相變焓，因此磷脂雙層膜更加穩定。Wang Qianqian等制備的魚油粗脂質體通過DSC分析儀測得相變溫度為56.17 ℃，低于本研究中制備的DHA藻油脂質體相變溫度。不同脂質體制備相關研究中相變溫度的差異可能是由于制備時使用的磷脂種類不同。磷脂中脂肪酸鏈的長度、飽和度直接決定了其相變溫度，一般脂肪酸鏈越長，相變溫度越高。

圖4 MF-L和C-L的DSC分析曲線Fig. 4 DSC thermograms of MF-L and C-L

2.4 穩定性分析結果

2.4.1 物理穩定性

通過Turbiscan快速穩定性分析儀分析了兩種不同處理方式脂質體的物理穩定性，圖5為動力學不穩定性曲線。TSI越大，表明體系越不穩定，相比之下C-L更容易發生聚沉，物理穩定性較低。前12 h內，MF-L表現出了良好的穩定性，TSI變化緩慢。12 h以后，雖然MF-L的變化幅度逐漸增大，但仍比C-L的TSI小。說明脂質體粒徑的降低對物理穩定性的提高有促進作用。本研究結果與邰克東等研究不同均質壓力對脂質體囊泡特性和物理穩定性影響的結論相似。

圖5 MF-L和C-L的動力學不穩定性曲線Fig. 5 Kinetic instability curves of MF-L and C-L

2.4.2 貯藏穩定性

如圖6～8所示，在貯藏期28 d內，4、25 ℃條件下MF-L和C-L表現出了不同的穩定特性，C-L在4 ℃下貯藏28 d后，平均粒徑由739.4 nm增大到942.7 nm（圖6），粒徑分布由雙重峰轉變成不規則的多重峰（圖7B、E），且藻油泄漏嚴重（圖8），油腥味加劇。兩種溫度下的C-L包封率呈現迅速下降的趨勢，出現絮沉，逐漸失去納米特性，在25 ℃下貯藏的脂質體絮沉程度比4 ℃下更加劇烈。MF-L在4 ℃條件下貯藏28 d后，平均粒徑與包封率無明顯變化（圖6、8），其在兩種溫度條件下的粒徑分布圖峰形平滑，幾乎呈單峰分布（圖7C、D），且從外觀觀察，4 ℃條件下比25 ℃變化差異更小，呈半透明狀態分布均勻，無絮沉現象。以上實驗結果說明MF-L比C-L貯藏穩定性更好，低溫條件下貯藏脂質體更能維持其良好特性。

圖6 MF-L和C-L在不同貯藏溫度與時間下的平均粒徑變化Fig. 6 Variation in mean particle size of MF-L and C-L at different storage temperatures and times

圖7 第28天MF-L和C-L在不同貯藏溫度下的粒徑分布Fig. 7 Particle size distribution of MF-L and C-L after 28 days of storage at different temperatures

圖8 MF-L和C-L在不同貯藏溫度與時間下的包封率變化Fig. 8 Variation in encapsulation efficiency of MF-L and C-L as a function of storage time at different temperatures

2.4.3 氧化穩定性

通過過氧化值的測定評價DHA藻油脂質體的氧化穩定性。由圖9可知，隨著貯藏時間的延長，4 ℃條件下MF-L和C-L的過氧化值都緩慢增長，且MF-L的過氧化值漲幅低于C-L。7～14 d，25 ℃下C-L過氧化值降低了0.031 mmol/kg，原因是脂質氧化是一個連鎖反應過程，脂質體在初級氧化產物的基礎上會進一步生成次級氧化產物。從第21天開始，過氧化值呈現明顯的上升趨勢，25 ℃比4 ℃條件下過氧化值增長速率更快，且C-L的漲幅更大。C-L在貯藏期間大量泄漏油脂，酸敗程度加劇。第28天時，25 ℃下C-L具有最高的過氧化值，為（1.840±0.332）mmol/kg。與之相比，MF-L抗氧化能力更強，且4 ℃貯藏效果最好，第28天時過氧化值為（0.353±0.106） mmol/kg。這可能是高壓微射流的作用使脂質體結構更加穩定，一方面減少了油脂泄漏量，限制了過氧化物的產生；另一方面磷脂雙層對藻油起到了很好的保護作用，防止其被氧化。同時，溫度是貯藏過程中的關鍵影響因素，在低溫條件下貯藏脂質體有益于產品功能的保持。

圖9 MF-L和C-L在不同貯藏溫度與時間下的過氧化值Fig. 9 Peroxide values of MF-L and C-L as a function of storage time at different temperatures

3 結 論

本實驗以平均粒徑、包封率為主要指標，采用響應面法優化了DHA藻油脂質體的高壓微射流均質制備工藝。得到制備的最佳工藝條件為：磷脂質量濃度20 mg/mL、磷脂與藻油的質量比4∶1、磷脂與膽固醇質量比11.9∶1、吐溫-80用量15%、均質壓力138 MPa、均質次數5 次。在此條件下進行制備，DHA藻油脂質體平均粒徑為（59.35±3.05）nm，PDI為0.189±0.025，包封率（94.2±2.9）%。透射電子顯微鏡觀察結果表明，高壓微射流均質DHA藻油脂質體微觀結構為球狀，分布均勻。通過與未經高壓微射流技術處理的脂質體對比，高壓微射流均質制備的DHA藻油脂質體相變溫度有所提高，并在保持穩定性上有一定的優勢：28 d的貯藏期內，經處理的DHA藻油脂質體的貯藏穩定性、氧化穩定性良好，且在低溫條件下貯藏效果較為理想。本實驗所用方法為實際加工中DHA藻油脂質體的應用提供了一定的技術支持，具有廣闊的應用前景。