β-蛻皮甾酮通過調控β-catenin/BMP表達促進骨髓間充質干細胞分化治療骨質疏松性骨折的作用機制

莫亞峰 周坤 王徐剛 熊振飛 湯樣華*

骨質疏松性骨折（osteoporotic fractures，OF）是骨質疏松最嚴重的并發癥，流行病學結果顯示，我國OF患者已達223萬例，預計2050年將達到599萬例[1-2］。人口老齡化導致骨質疏松癥的患病率不斷上升，并發骨質疏松性骨折的幾率也相應增高。而現代醫學研究已證實骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）、β-連環蛋白（β-catenin）在骨髓間充質干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）成骨分化過程中起關鍵作用[3-4］。中藥牛膝是中醫骨傷科常用藥物，具有補肝腎、強筋骨作用。本研究擬通過建立去卵巢骨質疏松性骨折小鼠模型、進行分組藥物干預對照實驗，以明確牛膝有效成分β-蛻皮甾酮是否可通過提高β-catenin/BMP表達水平，動員BMSCs的活性，促進其定向分化，發揮治療骨質疏松骨折的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3個月齡TOPGAL小鼠50只，雌性，SPF級，質量（28.5±2.6）g，由上海中醫藥大學動物實驗中心訂購。實驗動物飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心。所有小鼠在整個實驗過程中均自由飲水和進食。

1.2 實驗藥物與試劑 β-蛻皮甾酮（上海諸德生物科技有限公司）；仙靈骨葆膠囊[國藥準字Z20025337，規格：0.5 g/粒，國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司］，膠囊內容物與蒸餾水混合制成相應濃度混懸液；氯胺酮（西安力邦制藥有限公司）；10%中性福爾馬林（廣州維格斯生物科技有限公司）；14%乙二胺四乙酸（EDTA）、蘇木素染液，均購于北京百奧思科生物醫學技術有限公司；鹽酸乙醇分化液、伊紅染液、甘油明膠封片劑、甲苯胺藍染色試劑，均購于武漢谷歌生物科技有限公司；兔多克隆Anti-β-catenin、羊抗兔IgGBiotin，均購于英國abcam公司；DAB顯色試劑盒，購于北京中衫金橋生物技術有限公司；超敏雌二醇試劑盒，購于西門子醫學診斷產品（上海）有限公司；磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），購于美國Hyclone公司；牛血清白蛋白（BSA），購于碧云天生物技術有限公司。

1.3 實驗儀器 超凈工作臺（AIRTECH公司）；電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；小型臺式冷凍型離心機（德國Eppendorf公司）；SN-697γ計數器（上海核所日環光電儀器有限公司）；Micro-CT（瑞士Scanco Medical公司）；全自動免疫組化染色系統[丹科醫療器械技術服務（上海）有限公司］；VS120-SL全片組織掃描儀（美國Olympus公司）。

1.4 實驗方法 （1）去卵巢骨質疏松性小鼠模型的建立[5］：選取3個月齡雌性TOPGAL小鼠，經氯胺酮（0.1g/kg）腹腔注射麻醉后，取俯臥位，選取肋弓下第3～4腰椎處作為手術入路，備皮后碘伏消毒，經腰背側正中無菌操作下鈍性分開腰部筋膜、肌肉，切開腹膜，分離、暴露卵巢，結扎輸卵管和周圍血管后摘除卵巢。隨后以相同的方法摘除對側卵巢。在確保雙側卵巢摘除后，逐層縫合腹膜至皮膚，慶大霉素注射手術切口。選取40只小鼠均按上述方法行雙側卵巢摘除。另外，隨機選取10只小鼠進行假手術，不摘除卵巢，僅去除卵巢周圍部分脂肪組織，作為假手術組；3個月后從行雙側卵巢摘除的40只小鼠中隨機選取10只作為去卵巢組，與假手術組小鼠同時處死后進行指標檢測（包括子宮重量測定、血清雌二醇水平測定和脛骨近端micro-CT掃描），以證實去卵巢骨質疏松性小鼠模型的造模成功。（2）骨質疏松性骨折小鼠模型建立[5］：選取30只去卵巢骨質疏松性小鼠，經氯胺酮（0.1 g/kg）腹腔注射麻醉后，取仰臥位，選取左側脛骨備皮消毒，無菌操作下切開小鼠脛骨前緣皮膚1.5 cm，鈍性分離脛骨內外側組織，髓內針由脛骨平臺處插入脛骨上1/3處時，使用手術剪避開脛骨內側深部肌肉在1/3處完全橫斷脛骨后，髓內針頭繼續插入骨折斷端下部骨腔約3/4長度時剪斷，完成手術后逐層縫合。（3）分組與藥物干預：將30只骨質疏松性骨折小鼠隨機均分為空白對照組、β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組，每組各10只。小鼠骨折術后第2天分別給予0.9%氯化鈉溶液及相應藥物0.5 mL灌胃治療，1次/d，連續灌胃治療4周后取材進行相關指標檢測。（4）以放射免疫分析法測定血清雌二醇水平[6］：灌胃4周后，3組小鼠眼球取血處死，血液裝入1.5 mL無菌EP管中，室溫放置20～30 min，后于4℃下以3,000 r/min，離心15 min，分離出血清液移入新的EP管中，-80℃保存。將低溫保存的血清液樣本送至上海中醫藥大學核醫學放射免疫實驗室，由實驗室工作人員使用超敏雌二醇試劑盒，SN-697γ計數器完成檢測。（5）以影像學掃描（X線、Micro-CT）檢測小鼠脛骨愈合情況[7］：灌胃4周后，3組小鼠眼球取血處死，立即取出左側脛骨，剔除多余軟組織；選取脛骨下段近關節處，剪斷暴露骨髓腔（利于脛骨內骨髓固定），浸入10%中性福爾馬林中固定48 h后予更換75%乙醇長期固定保存，分別進行X線及Micro-CT掃描，統一定位左側脛骨上段1/3處，分辨率為18μm逐層掃描成像及三維重建。（6）β-蛻皮甾酮對β-catenin、BMP-7表達水平的影響：3組小鼠左側脛骨Micro-CT掃描結束后，14%EDTA（PH7.4）進行脫鈣處理3～4周，第1周更換脫鈣液1次/d，第2～3周更換1次/2 d。X線確認脫鈣完全后，再進行脫水、石蠟包埋處理，矢狀位連續切片（4～5μm）。并對標本進行HE、免疫組化染色，使用Olympus VS120-SL采片、分析。①以蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色進行病理學觀察分析[5，7］：石蠟切片60℃烤箱5 min，常規二甲苯脫蠟，經乙醇至水洗，吸干水后蘇木素染液2 min，蒸餾水沖洗1 min，吸干水后鹽酸乙醇分化5 s，氨水返藍15 s，蒸餾水沖洗，吸干水后以伊紅染液2 min，蒸餾水清洗。脫水后，梯度乙醇分化，二甲苯透明，中性樹膠封固，使用Olympus VS120-SL于20倍目鏡下觀察。②以免疫組化染色觀察β-catenin、BMP-7的蛋白表達水平[5，7］：石蠟切片60℃烤箱5 min，常規脫蠟至水，蒸餾水沖洗1 min，滴加甲醇：過氧化氫（1∶9），室溫下孵育15 min，蒸餾水沖洗，滴加抗原修復液：蒸餾水（1∶50），高溫高壓至（105℃，0.025Kpa），自然冷卻至室溫，PBS洗片2 min×3次，5%BSA封閉20 min。37℃下滴加一抗（β-catenin：1%BSA 1∶500、BMP7：1%BSA 1∶200），4℃過夜后PBS洗片2 min×3次，滴加羊抗兔IgG-Biotin；37℃孵育15 min，PBS洗片2 min×3次，滴加SABC；室溫15 min后，PBS洗片2 min×3次，滴加DAB顯色液（蒸餾水1 mL+D1 50μL+D2 100μL+D3 50μL）；室溫孵育3～10 min，梯度乙醇分化，二甲苯透明，中性樹膠封片，在Olympus VS120-SL 20倍目鏡下觀察。1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清雌二醇含量測定結果 β-蛻皮甾酮組及仙靈骨葆組血清中雌二醇含量均明顯高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 藥物對去卵巢小鼠血清雌二醇含量的影響[pg/mL，（±s）］

表1 藥物對去卵巢小鼠血清雌二醇含量的影響[pg/mL，（±s）］

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，#P＜0.05

組別 雌二醇空白對照組 3.27±3.40 β-蛻皮甾酮組 8.14±4.19*仙靈骨葆組 12.23±4.92*#空白對照組

2.2 X線檢測結果 空白對照組骨折端少量稀疏骨痂通過和少量外骨痂形成，骨折線可見；而β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組骨折端外骨痂致密，部分髓腔再通，骨折線模糊。見圖1。

圖1 X-ray檢測結果的比較

2.3 micro-CT掃描結果 空白對照組骨皮質厚度明顯變薄，骨小梁稀疏、數量顯著減少；β-蛻皮甾酮組與仙靈骨葆組骨皮質厚度明顯優于空白對照組，骨小梁結構相對緊密、均勻。見圖2。

圖2 micro-CT掃描結果

2.4 HE染色結果 與空白對照組比較，β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組小鼠骨小梁數量、密度均得到明顯改善，骨痂形狀更為規則，與骨皮質貼合程度更高，其中以β-蛻皮甾酮組效果最佳。見圖3。

圖3 骨組織HE染色（×20）

2.5 免疫組化染色結果 β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組BMP-7、β-catenin表達陽性水平高于空白對照組，染色較深，但以β-蛻皮甾酮的密集度更高，染色更深。見圖4。

圖4 骨組織免疫組化染色（×20）

3 討論

骨質疏松性骨折由于骨質量差和骨強度低易發生骨折延遲愈合或不愈合、骨折術后內固定松動等[8］。因此如何在治療原發病的同時促進骨折愈合，縮短治療周期，降低再次骨折發生率，是當前骨質疏松性骨折治療的難點。目前臨床上使用的藥物以特立帕肽、雙膦酸鹽類等化學藥物為主，臨床使用中存在局限性和并發癥[9-10］。

本研究結果顯示，與空白對照組比較，β-蛻皮甾酮組、仙靈骨葆組能明顯提高骨質疏松性骨折小鼠血清雌二醇水平（P＜0.05），但β-蛻皮甾酮組效果稍遜于仙靈骨葆組，表明β-蛻皮甾酮可以通過提高雌二醇含量實現抗骨質疏松作用。X線檢測結果顯示，空白對照組骨折端少量稀疏骨痂通過和少量外骨痂形成，骨折線可見；而β-蛻皮甾酮組和仙靈骨葆組骨折端外骨痂致密，部分髓腔再通，骨折線模糊。Micro-CT掃描結果顯示，空白對照組骨皮質厚度明顯變薄，骨小梁稀疏、數量顯著減少；β-蛻皮甾酮組與仙靈骨葆組骨皮質厚度明顯優于空白對照組，骨小梁結構相對緊密、均勻。表明，β-蛻皮甾酮能促進去卵巢小鼠骨質疏松性骨折的愈合，增加骨痂、骨量。

此外，在抗骨質疏松以及骨折愈合過程中，BMSCs成骨分化起重要作用。BMSCs成骨分化潛力是影響骨再生和重建的重要因素，當BMSCs更偏向于向脂肪細胞分化時骨形成明顯減少則容易導致骨質疏松，甚至發生骨質疏松性骨折[11-12］。目前研究中，Wnt/β-catenin信號通路、BMP信號通路均被證明在調節BMSCs成骨分化中的發揮重要作用[13］。文獻報道，在Wnt/β-catenin信號通路中，由Wnt蛋白參與形成的三聚體復合物可以阻止β-catenin蛋白磷酸化降解，β-catenin蛋白在細胞中的濃度升高，最終激活下游靶基因[14］。高表達的β-catenin蛋白可以促進BMSCs向成骨細胞分化[3］。而BMP信號通路則通常由BMP作為啟動因子，促進下游Smad磷酸化，最終誘導BMSCs成骨分化[15］。且有研究證實，BMP-7是該信號通路的主要啟動因子之一，可作為評價BMSCs分化能力的重要指標[4，16］。此外文獻報道顯示，Wnt/β-catenin信號通路與BMP信號通路在BMSCs成骨分化的不同階段起協調作用[17］。為驗證β-蛻皮甾酮是否可通過調控β-catenin/BMP通路發揮促進BMSCs成骨分化的作用，本研究通過比較各組小鼠脛骨HE染色及免疫組化染色后的β-catenin、BMP-7表達水平，發現β-蛻皮甾酮可有效增強去卵巢小鼠骨痂中BMP-7和β-catenin的表達，從而提高骨髓間充質干細胞分化能力，增加成骨細胞含量。

綜上所述，β-蛻皮甾酮可通過增強BMP-7、β-catenin表達促進BMSCs定向分化，發揮治療骨質疏松性骨折的作用。但本實驗尚未揭露BMP-7和β-catenin是否具有上下游關系，需進行進一步研究。