益氣活血通脈顆粒調控小膠質細胞介導腦缺血再灌注損傷的作用機制

湯俏璐 段莉琴 嚴民力*

缺血性腦卒中具有高致殘率、高病死率，其有效治療仍然是目前臨床上的難點[1］。缺血性腦卒中發生血液再灌注可導致腦缺血再灌注損傷[2］，其形成的過程涉及到氧化應激反應、炎癥反應等[3］。在病理或正常環境下，中樞神經系統中小膠質細胞可以被激活并釋放抗炎因子、神經調節因子，清除有害物質，并指引干細胞向炎癥灶遷移，促進神經元的再生和存活[4-6］。同時也可以釋放出多種炎癥因子，引起炎癥反應，損害腦組織[7］。有研究表明益氣活血通脈顆粒可有效改善腦缺血再灌注模型大鼠顳葉神經元損傷[8］。本文探討益氣活血通脈顆粒通過調控小膠質細胞介導腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞 SPF級雄性SD大鼠，24只，6～8周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司所提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0015，動物合格證號：20170005024850，大鼠的飼養來源主要為杭州鷹旸生物科技有限公司。BV2小膠質細胞[iCell-m011，賽百慷（上海）生物技術股份有限公司）］。

1.2 藥物與試劑 DMEN培養基（批號：SH30243.01，Hyclone）；96孔 培 養 板（批 號：167008，Thermo）；0.22μm濾膜（批號：R7EA15981，MILLEX-GP）；小鼠活性氧簇（ROS）ELISA檢測試劑盒（批號：JL20383，上海江萊生物科技有限公司）；小鼠白細胞介素1β ELISA試劑盒（批號：MM-0040M1，江蘇酶免實業有限公司）；小鼠白細胞介素18 ELISA試劑盒（批號：MM-0169M1，江蘇酶免實業有限公司）。

1.3 實驗器材 酶標儀（型號：CMaxPlus，MD）；低溫高速離心機（型號：Micro17R，Thermo）；細胞培養箱（型號：BB150，Termo）。

1.4 實驗方法 （1）細胞培養：培養實驗用BV2小膠質細胞，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基進行相關的培養工作，所使用培養箱的溫度設置為37℃，二氧化碳含量為5%，每隔2～3 d進行傳代。（2）益氣活血通脈顆粒和含藥血清配方：甘草5 g，紅景天6 g，大棗6枚，生姜6 g，水蛭6 g，當歸10 g，赤芍10 g，桂枝10 g，益母草10 g，黃芪30 g，做成中藥顆粒劑，5 g/袋，每袋相當于12 g生藥。按體重將SD大鼠隨機分為空白對照組和中藥組，分別以0.9%氯化鈉溶液和中藥（8 g/kg）灌胃。每天8∶00及16∶00各灌胃1次，連續7d，最后一次灌胃后1 h，于腹主動脈中取出血液，進行離心分離血清，過濾后，-20℃冷凍待用。（3）BV2小膠質細胞氧糖剝奪/復氧模型的建立：此次實驗所用細胞的生長周期為對數生長期，將原培養板中的培養基棄去，用無添加糖的DMEM培養基代替，置于氧糖剝奪罐中孵育6 h，其間不斷補進5% CO2及95% N2混合氣體，將流量維持在2 L/min；隨后將培養板轉移出來，原培養液按實驗守則丟棄，另外添進新的DMEM/F12培養基，培養箱溫度設置為37℃，CO2含量為5%，繼續培養以達到復氧復糖的目的。（4）分組及干預：細胞分成4組，空白組、OGDR模型組、空白血清組、含藥血清組。除空白組外，其余三組均置于氧糖剝奪罐進行氧糖剝奪/復氧實驗。（5）BV2小膠質細胞培養后，800 r/min離心10 min，收集上清液，使用0.22μm微孔濾膜隔離濾液，過濾后所得的溶液置于冰箱-40℃進行儲存，檢測細胞上清中ROS、IL-18、IL-1β水平；①前期準備：將在冰箱里保存的試劑盒拿出，室內復溫20 min。配液：將20×洗滌液通過蒸餾水稀釋成原倍數的洗滌液；②加標準品和待測樣本：在框架上置放好所需酶標板，孔數分為3組，標準品組、待測樣本組及空白對照組，首先在標準品組添加50 μL標準品；待測樣本組添加10 μL待測樣本，繼續在待測樣本組添加40 μL樣本稀釋液；空白對照組無添加；③分別添加100μL的辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體進入標準品組和待測樣本組。④溫育：將反應孔封住，封膜用刮刀刮緊，以防漏液，置于水溫為37℃的水浴鍋中，或溫度為37℃的恒溫箱中溫育60 min；⑤洗板：棄液后用吸水紙拍干板子，然后在孔里注滿洗滌液，置于室內1 min，棄液后用吸水紙拍干，按步驟重復5次；⑥顯色：將50 μL顯色劑A溶液添加到每個孔中，然后添加50 μL顯色劑B溶液，可以應用平板混勻器使其得到充分混勻，時間30 s（也可以手動進行震蕩混勻，力度不能太大，時間30 s），避光置放于37 ℃的環境中顯色15 min；⑦終止：酶標板的每個孔均添加50 μL終止液，使反應不再繼續；⑧測定：用空白孔進行反應調零，反應停止后15 min內，通過450 nm波長分析每個孔的吸光值（OD值），實驗重復6次；⑨ELISA檢測：取各組細胞上清液，應用ELISA試劑盒檢測各組細胞中ROS、IL-1β、IL-18水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件。符合正態分布計量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小膠質細胞中ROS水平比較 與空白組比較，OGDR模型組與空白血清組小膠質細胞中ROS水平升高（P＜0.01），與空白血清組比較，含藥血清組小膠質細胞中ROS水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小膠質細胞中ROS水平比較[ng/L，（±s）］

表1 各組小膠質細胞中ROS水平比較[ng/L，（±s）］

注：與空白組比較，*P＜0.01；與空白血清組比較，#P＜0.05

組別 ROS空白組 374.11±33.73 OGDR模型組 458.8±27.50*空白血清組 471.26±33.18*含藥血清組 413.42±26.32#

2.2 各組小膠質細胞中IL-1β和IL-18水平比較 與空白組比較，OGDR模型組與空白血清組小膠質細胞中IL-1β和IL-18水平升高（P＜0.01），與空白血清組比較，含藥血清組小膠質細胞中IL-1β和IL-18水平降低（P＜0.01）。見表2。

表2 小膠質細胞中IL-1β和IL-18含量水平變化情況[pg/mL，（±s）］

表2 小膠質細胞中IL-1β和IL-18含量水平變化情況[pg/mL，（±s）］

注：與空白組比較，*P＜0.01；與空白血清組比較，#P＜0.01

組別 IL-1β IL-18空白組 42.45±4.39 18.88±2.34 OGDR模型組 105.98±12.22* 65.86±6.19*空白血清組 101.8±17.43* 66.73±9.16*含藥血清組 67.01±4.79* 38.66±4.69#

3 討論

缺血性腦卒中再灌注損傷病因與分子機制，包含氧化應激、炎癥、能量代謝損傷、谷氨酸鹽/神經毒性物質的釋放、鈣超載、凋亡及自噬過程[3］。中醫學將缺血性腦卒中歸類為中風，風滯、痰、火氣、癖、毒是形成缺血性腦卒中的病因。治療方法有活血益氣、祛除癖血、暢通血脈、提神醒腦、止咳化痰、通便、補腎補益氣等，臨床上應用中成藥、針灸與健康治療等方法，能明顯改善腦卒中患者的后遺癥與腦神經的恢復[9-10］。《醫林改錯》記錄的補陽還五湯劑是現代益氣活血通脈顆粒的由來，其功效是通氣、活血化癖、通脈絡、提神醒腦，在臨床應用中獲得較好的治療效果。

研究表明，缺血性腦卒中發病過程中，一旦出現炎癥反應，可引起腦神經衰亡、血腦屏障受損并且加重腦水腫等情況[11］，因此，為了防止炎癥造成二次腦組織傷害，治療炎性損傷已成為缺血性腦卒中預后的研究方向。小膠質細胞在炎癥治療過程中有重要作用，作為中樞神經系統吞噬細胞的小膠質細胞，其大致分為兩種狀態M1型與M2型，兩種極化狀態有促炎與抗炎兩種作用[4］。M1型狀態為細胞免疫應答，會產生多種炎癥介質和細胞毒性物質（ROS、TNF-α、IL-1、iNOS等），進而造成細胞組織損傷；M2型細胞加速細胞繁殖，產生神經營養因子和抗炎癥因子（BDNF、IL-10、IL-4、TGF-β等），能夠修復受損組織細胞[12］。缺血缺氧可使小膠質細胞高表達基質金屬蛋白酶-9，繼而活化、水解基膜蛋白，破壞血腦屏障、加劇中性粒細胞浸潤、誘導小膠質極化引發神經炎性反應和神經元損傷，使梗死面積不斷擴大[13］。

本研究結果顯示，與空白組比較，OGDR模型組與空白血清組小膠質細胞中ROS水平升高（P＜0.01），與空白血清組比較，含藥血清組小膠質細胞中ROS水平降低（P＜0.05）。表明益氣活血通脈顆粒可以減弱缺氧復氧導致的小膠質細胞氧化應激反應，保護腦組織。Nod樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體大多數在小膠質細胞里，如感受到內源的危險刺激信號，NLRP3炎癥小體會有所反應，從而產生促炎細胞分子，如IL-1β和IL-18，從而加重腦缺血后的炎癥反應[14-15］。本研究結果顯示，益氣活血通脈顆粒可以降低小膠質細胞IL-1β、IL-18水平。表明，益氣活血通脈顆粒可以減弱缺氧復氧導致的小膠質細胞炎癥反應和炎性損傷。

綜上所述，益氣活血通脈顆粒可能通過調節小膠質細胞NLRP3炎癥小體，從而降低ROS及IL-1β、IL-18的分泌，進一步減弱缺氧復氧導致的小膠質細胞氧化應激反應及抵抗缺氧復氧導致的小膠質細胞炎性反應，改善缺血性腦卒中患者的預后。