中華絨螯蟹對石油烴的富集代謝規律及閾值研究

關 麗，郭欣碩，徐小雅，黃萍萍，藺翠翠

(遼寧省現代農業生產基地建設工程中心，遼寧 沈陽 110003)

石油烴污染是當今世界各國普遍關注的污染問題之一，隨著我國石油化工產業的發展，部分海區、河流和底質受到石油類污染[1-2]，水產品的產地環境也面臨著石油烴污染的威脅，石油烴污染不僅影響水產品的食用價值，而且其致癌性、致畸性和難降解性也令消費者“談油色變”，嚴重影響水產品的經濟價值[3-5]。中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是我國特有的大型淡水蟹類，因具有特殊的風味和豐富的營養價值及藥用價值而廣受國人青睞。近年來，我國的中華絨螯蟹產量逐年增長，目前年產量已達到80×104t左右[6]，根據農業農村部公布的《2021中國漁業統計年鑒》的數據計算，中華絨螯蟹產量占我國淡水水產品總產量的2.4%左右[7]。中華絨螯蟹已成為我國一種重要的淡水水生生物資源。

目前，國內外學者對石油烴在生物體內的富集機理及組織器官間的分布等進行了許多研究[8-9]。石油烴對我國水生生物的污染動力學研究主要集中在其對藻類、貝類、魚類等物種早期發育的影響[10-12]，而石油烴對甲殼類的污染動力學研究相對較少，甲殼類對石油烴的富集代謝規律及石油烴在養殖環境和甲殼類體內的含量關系等方面仍缺少系統的研究。因此，本研究選用甲殼類中具有代表性的中華絨螯蟹為對象，通過生態實驗手段和化學分析相結合的方法，在實驗室模擬研究了中華絨螯蟹對石油烴的富集代謝規律，量化石油烴在中華絨螯蟹體內的生物富集系數(Bioconcentration factor，BCF)，根據蟹體內石油烴的限量判定其安全閾值，旨在為制定中華絨螯蟹的健康化養殖規范和衛生標準提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用水

遼寧省盤錦市大洼縣稻田蟹養殖水經脫油過濾、48 h沉淀、氣石曝氣后，備用。溶解氧濃度大于8.0 mg/L，水溫20～23℃。

1.1.2 實驗生物

實驗受試生物中華絨螯蟹均取自盤錦稻田蟹養殖區，體質量50 g左右，雌、雄隨機，實驗前暫養7 d，選擇大小適宜、健康無病、活動正常的中華絨螯蟹，備用。

1.1.3 石油烴標準品

石油烴標準品(1 000 mg/L)，編號GBW(E)080913，購于國家海洋環境監測中心。

1.1.4 石油烴母液(WSF)的配制

1 L燒杯中加入0#柴油和實驗用水，體積比約為1∶1，磁力攪拌器攪拌24 h，放置分層，虹吸下層溶液作為實驗用母液。穩定后測定母液中石油烴濃度為2.25 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 水中石油烴的測定

采用HJ 637—2012《水質 石油類和動植物油類的測定 紅外分光光度計法》[13]測定水中石油烴濃度。

1.2.2 中華絨螯蟹中石油烴的測定

參照GB 17378.6—2007《海洋監測規范 第6部分 生物體分析》，采用熒光分光光度法[14]測定中華絨螯蟹中的石油烴含量。

1.2.3 生物富集實驗

設3個實驗組、1個空白對照組，每組設2個平行，每個容器40只中華絨螯蟹。以體積約30 L的水族箱作為實驗容器，加入10 L實驗用水。內置一個循環泵充氧，水中溶解氧濃度不低于8.0 mg/L。3個實驗組養殖水體中石油烴濃度分別為2.25、1.81和1.43 mg/L，穩定24 h后放入中華絨螯蟹進行生物富集，分別于富集的0.5、1、2、4、6、8、10、12和14 d采集中華絨螯蟹樣品，各實驗組隨機選取2只中華絨螯蟹，剪碎去殼后，取肌肉和內臟團混合并用勻漿器勻漿，置于-18℃保存，待測石油烴含量。

中華絨螯蟹對石油烴的富集能力用生物富集系數(BCF)表示。BCF=Cfs/Cws，式中Cfs為平衡時生物體內石油烴含量；Cws為平衡時養殖水體中石油烴濃度。

1.2.4 感官評定實驗

實驗組別和實驗條件同1.2.3，每個容器20只中華絨螯蟹，3個實驗組濃度分別為2.25、1.81、1.43 mg/L，穩定24 h后放入中華絨螯蟹進行生物富集，分別于富集的3、6、12、24、30、40和48 h從各實驗組中隨機選取2只中華絨螯蟹，剪碎混合后用勻漿器勻漿，待測石油烴含量。同時把取得的中華絨螯蟹樣品按順序編號。

感官評定根據《感官分析方法總論》[15]和《出口水產品品質檢驗——水煮檢驗法》[10]進行，詳見表1。參加感官評定的人員共分3組，每組5人，以多數人的感官判斷結論作為本實驗的感官評定結果。具體方法：容器裝入水，將洗凈的中華絨螯蟹樣品上屜蒸15 min，用手扇蒸氣嗅別，再嘗口味。判斷標準如表1所示。

表1 感官評定判斷標準

1.2.5 石油烴代謝實驗

將富集實驗的3個實驗組養殖水體換成空白養殖水體后繼續養殖，其他實驗條件與1.2.3生物富集實驗相同，并分別于換水后的0.5、1、2、4、6、8、10、12和14 d從各實驗組中隨機選取2只中華絨螯蟹，剪碎混合后用勻漿器勻漿，待測石油烴含量。

1.2.6 安全閾值實驗

實驗組別和實驗條件同1.2.3，實驗組水體石油烴濃度為國家限量標準0.05 mg/L[16]，穩定24 h后放入中華絨螯蟹進行生物富集，分別于富集后的7、14和21 d從各實驗組中隨機選取2只中華絨螯蟹，取性腺、肝胰腺和肌肉等可食部分，剪碎混合后用勻漿器勻漿，測定石油烴含量。

1.2.7 數據統計

石油烴含量數據采用平均值±標準差(Mean±SD)表示；數據統計分析采用SPSS 19.0軟件，進行單因素方差分析(ANOVA)及相關性分析，顯著性差異水平P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 水中石油烴含量的測定

測定濃度為1、2、5、8、10 μg/mL的石油類標準系列溶液，得出水中石油烴的標準曲線回歸方程：y=0.066 291x+0.009 961 3(R2=0.999 31)，線性關系良好。

2.2 中華絨螯蟹中石油烴含量的測定

測定濃度為0、1、3、5、7、9 μg/mL的石油類標準系列溶液，得出中華絨螯蟹中石油烴的標準曲線回歸方程：y=-1.048 6x+0.014 551(R2=0.999 42)，線性關系良好。

2.3 富集規律

各實驗組的富集量及差異性分析見表2，可以看出3個不同濃度組中中華絨螯蟹均表現出明顯的蓄積效應，隨著濃度增加和實驗時間的推進，蟹體內石油烴含量明顯增大。總體上，各組間及同一組不同富集天數的蓄積量差異極顯著。

富集實驗初期，各實驗組對石油烴的富集速度較快，呈現出快速增長的趨勢，隨著實驗的推進，各實驗組的石油烴富集逐漸趨于飽和且呈現緩慢增長的趨勢，最終各實驗組蟹體對石油烴的富集達到飽和，富集濃度不再明顯增大。各實驗組石油烴在蟹體內和養殖水體之間達到穩態平衡的時間均為8 d左右，經計算，各實驗組石油烴平均富集速率由大到小分別為22.0 mg/(kg·d)(實驗組1)、9.05 mg/(kg·d)(實驗組2)、6.97 mg/(kg·d)(實驗組3)。蟹體對石油烴的富集量與養殖水中石油烴濃度呈正相關關系，即養殖水體中石油烴濃度越大，蟹體富集的石油烴含量越高，進一步利用SPSS 19.0統計軟件，對表2各實驗組在不同富集時間蟹體內石油烴含量的結果進行相關性分析，得出中華絨螯蟹體內石油烴富集量和養殖水體中石油烴濃度在0.01水平上呈現顯著相關，相關系數為0.654。

表2 生物富集實驗中華絨螯蟹體內石油烴含量

BCF指污染物在生物體內富集達到穩態平衡時，生物體內污染物濃度與水環境中污染物濃度的比值，是評估水生生物對污染物富集水平的一個重要參數[16-17]。通過測定BCF值可以反推水環境中污染物的安全限量。如表2所示，經過8 d左右，不同濃度實驗組石油烴在養殖水體中和蟹體內均達到了分配穩態平衡。通過表3、圖1，由富集實驗8～14 d中華絨螯蟹和養殖水體中的石油烴含量結果可推算，實驗組1、2和3的BCF平均值分別為58.6、39.1和31.7，因此中華絨螯蟹對石油烴的BCF為31.7～58.6，平均值為43.1。

表3 中華絨螯蟹生物富集系數計算結果

2.4 感官評定

人類的嗅覺、味覺對石油烴異味比較敏感，因此可以用感官評定法對經過石油烴富集后的中華絨螯蟹的食用性作出感官判斷。感官實驗結果見表4，實驗組3的各時間段中華絨螯蟹煮熟后，氣味和口味正常，感官評定人員未發現有石油烴異味存在。實驗組2的中華絨螯蟹煮熟后，基本無異樣，但是當富集時間達到40 h時，中華絨螯蟹體中石油烴含量達到12.09 mg/kg，蟹體出現輕微的石油烴異味，已不適宜食用。實驗組1的中華絨螯蟹在石油烴富集6 h后便開始出現少量的石油烴異味；當富集時間累積達到12 h時，中華絨螯蟹體中石油烴含量為15.07 mg/kg，其可產生口味異味；當富集時間累積達到24 h時，中華絨螯蟹體中石油烴含量達到44.62 mg/kg，已能夠被明顯分辨出石油烴異味，已嚴重影響了中華絨螯蟹的品質，完全不適宜食用。因此根據本實驗結果，確定中華絨螯蟹的石油烴異味閾值為12.09～15.07 mg/kg。

表4 石油烴感官評定結果

2.5 代謝規律

將3個實驗組的中華絨螯蟹從含有石油烴的養殖水體中更換至空白養殖水體中，進行石油烴污染物的代謝規律研究，不同代謝時間段對中華絨螯蟹體中石油烴殘留量的檢測結果見表5。由于代謝實驗中每天更換實驗用水，因此石油烴趨向于由生物體向養殖水體中排放的趨勢，但是由于石油烴的難代謝、難降解等特性，使其代謝排出的速度趨于逐漸放緩。各實驗組的中華絨螯蟹隨著養殖環境中石油烴的去除，其體內的石油烴含量均表現出降低趨勢，高濃度組的中華絨螯蟹排出石油烴的速度較快，中、低濃度組的中華絨螯蟹排出石油烴速度較慢，整體上，實驗組間和實驗組內的不同時間段蟹體內石油烴含量的差異極顯著。經過14 d代謝實驗后，各實驗組蟹體內石油烴的含量均大幅降低，實驗組1蟹體內石油烴的平均含量由131.24 mg/kg降低至21.27 mg/kg，實驗組2和實驗組3蟹體內石油烴含量均降至初始含量的1/5左右，且低濃度組(實驗組3)蟹體內石油烴含量最終降至國家標準要求的限量15 mg/kg以下，但中、高濃度組(實驗組2和實驗組1)實驗蟹體內的石油烴含量仍未降至限量以下。

表5 代謝實驗中華絨螯蟹體內石油烴含量

2.6 安全閾值

在中華絨螯蟹養殖水體中添加濃度為國家限量標準0.05 mg/L的石油烴并用其養殖中華絨螯蟹21 d，結果表明，蟹體內石油烴含量在7 d左右達到含量最大值2.21 mg/kg，14 d和21 d均降低至檢出限(1.0 mg/kg)以下，均低于農業行業標準對中華絨螯蟹體中石油烴的限量要求。因此，養殖水體中石油烴的安全閾值為0.05 mg/L。

3 討論

3.1 中華絨螯蟹體中石油烴異味閾值

石油烴異味實驗結果顯示，當蟹體內石油烴含量達12.09 mg/kg時，中華絨螯蟹可產生氣味異味；當石油烴含量達15.07 mg/kg時，中華絨螯蟹可產生口味異味，因此本研究確定12.09～15.07 mg/kg為中華絨螯蟹出現石油烴異味的閾值，這小于魚類50～100 mg/kg和雙殼貝類25～30 mg/kg的石油烴異味閾值[8]。農業農村部標準NY 5073—2006《無公害食品 水產品中有毒有害物質限量》中規定水產品中石油烴限量為15 mg/kg，而當中華絨螯蟹體內石油烴含量為12.09 mg/kg時，即可通過氣味辨識出石油烴的存在，但其異味閾值區間12.09～15.07 mg/kg也基本在限量之下，因此即使在安全限量以下的中華絨螯蟹產品也有可能產生石油烴異味，從而影響中華絨螯蟹的食用品質。

3.2 生物富集代謝規律

中華絨螯蟹對石油烴的富集呈現出前期快、后期慢的規律，這與其他水生生物對石油烴的富集規律一致[18]，富集放緩與中華絨螯蟹的外殼屏障作用、蟹體特殊的生理結構和體內各類酶對有害物質的防御機制有關[19]。蓄積8 d左右，石油烴在養殖水體中和蟹體內處于動態平衡，這與姜朝軍等[10]對菲律賓蛤仔的實驗結果4 d相比，穩態平衡所需的時間更長，因此石油烴在蟹體中的富集較貝類緩慢。在富集實驗養殖水體中，石油烴濃度與蟹體內石油烴的蓄積量呈現正相關關系，在0.01水平上相關系數為0.654，由此可知養殖環境中的石油烴可直接導致蟹體的石油烴污染，并表現出顯著的相關性。

BCF是評估水生生物對污染物富集水平的一個重要參數，本實驗得到中華絨螯蟹對石油烴的BCF為31.7～58.6，平均值為43.1，而姜朝軍等[10]研究貝類對石油烴的BCF為545；林建清等[20]研究鱸魚對石油烴中毒性最強的多環芳烴的BCF大于500。與之相比，本研究中華絨螯蟹對石油烴的蓄積水平低于貝類和魚類，但蔡玉婷等[21]對福建沿海生物體內石油烴含量的監測結果是甲殼類中石油烴含量介于魚類和貝類之間，出現結果偏差的原因可能是石油烴的組成和特性、水溫、pH、受試生物大小、性別、品質、生長周期、養殖水體中石油烴的濃度等諸多因素都會對BCF值產生影響，因此不同研究實驗所測得的BCF值會存在較大的差異[17,22]。

中華絨螯蟹體內石油烴的排出規律同樣呈現出前期快、后期慢并逐漸趨于平衡的規律，通過把受石油烴污染的中華絨螯蟹放置在潔凈環境中養殖一段時間后，結果可明顯降低中華絨螯蟹體內石油烴的殘留量，但即使經過與富集時間相同的天數后，中華絨螯蟹體內的石油烴含量仍未恢復到富集初期水平，蟹體內的石油烴含量越高，其代謝周期越長，由此可見，石油烴具有難代謝性。石油烴成分復雜，其中多環芳烴(PAHs)是造成其難代謝的主要成分，它不僅降解率低，還會導致生物受到毒害。多環芳烴的成分也十分復雜，其中某些組分的癌癥潛伏期長達50年[10]。由于石油烴的難代謝性和強毒性，圍繞石油烴的相關研究越發受到各地漁業部門的重視[23-25]。

3.3 養殖水體中石油烴安全閾值的探討

根據農業農村部NY 5361—2016《無公害農產品 淡水養殖產地環境條件》對養殖水體中石油烴的限量要求，甲殼類養殖水體中石油烴的安全限量為0.05 mg/L[26]。當養殖水體中石油烴濃度為0.05 mg/L時，中華絨螯蟹中富集的石油烴含量在12 mg/kg以下，低于石油烴的異味閾值，也低于我國現存的甲殼類石油烴的安全限量[27]，因此根據本文的實驗結果，0.05 mg/L作為養殖水體中石油烴的安全限量是比較合理的。