呼倫貝爾草甸草原土壤古菌群落多樣性高通量分析

高明華，于春艷，劉金月，于鳳蒞，孫廣霽

（呼倫貝爾學院生命科學學院，內蒙古 呼倫貝爾 021008）

草地生態系統是由植被生態系統、土壤生態系統和微生物生態系統組成，其分布廣泛，面積巨大，是重要的自然資源。內蒙古呼倫貝爾草原為溫帶草原，具有極其重要的生態服務功能、蘊含著巨大的碳匯資源，同時還是綠色畜產品的生產地和優質牧草的輸出地。因此如何客觀評價草地的利用與保護之平衡，就顯得尤為重要。放牧和刈割是天然草場管理和利用的主要方式，也是兩個主要人為干擾因素[1]。放牧和刈割一方面影響著植被生態系統，另一方面還會對土壤微生物產生的影響。近年很多天然草地實施了圍封管理，研究表明，圍封也是保護草地生態系統的重要措施之一。

微生物是草地生態系統的重要組成部分，推動了土壤的發生和發育，是生態系統物質與能量交換的重要紐帶，維系著草地生態系統的可持續發展。土壤微生物學是生命科學與地球科學的新興學科與交叉前沿，是地球元素生物化學循環的引擎[2]。同時，土壤微生物在草地生態系統的合理利用和土壤生態系統的保護方面也具有指示和指標作用。土壤微生物的多樣性與群落結構是當今生物多樣性研究的熱點[3]。

古菌域是不同于細菌域與真核生物域的獨立生命域，也是微生物的重要組成部分。土壤細菌和土壤真菌的群落結構、多樣性以及在維持土壤肥力和可持續發展方面的研究已開展多年，但是古菌在土壤中的生物多樣性及功能近些年才被關注。目前國內古菌群落研究可見于水生態系統[4]、農田土壤[5-6]等，關于草甸草原土壤古菌研究尚未有報道。本研究采用高通量測序技術（High-throughput sequencing，HTS），分析了不同利用方式下呼倫貝爾草甸草原土壤古菌群落的結構、多樣性和功能，以揭示不同利用方式對草原影響的微生物學本質和古菌之作用，為草原土壤微生物多樣性保護和利用提供理論依據。

1 研究區概況

試驗樣地位于呼倫貝爾草甸草原腹地，地理位置為E119°36′326″～119°59′856″，N49°17′781″～50°19′991″，海拔629～635 m。植被群落的主要物種有羊草（Lepidum chinense）、貝加爾針茅（Stipa baicalensis）等。試驗地區屬于中溫帶半干旱大陸性季風氣候，年降水量356 mm，主要集中在7—9月份，變動幅度較大；年均氣溫-2.36℃，最高氣溫36.8℃，最低氣溫-48.1℃。年積溫1 580～1 860℃，無霜期112 d。土壤類型是暗栗鈣土。

2 研究方法

2.1 土壤樣品的采集與處理

于2018年植物的生長旺季（8月份）在呼倫貝爾草原上進行野外觀測及采樣。試驗樣地（3塊）位于呼倫貝爾草甸草原，利用方式分別為刈割（Y）、放牧（F）和圍封（W），每塊樣地設置3個樣方（20 m×20 m），每個樣方內采用5點取樣法采集0～10 cm土屋（分別為Y1、F1和W1）和10～20 cm（分別為Y2、F2和W2）土層樣品混合成1個土壤樣本，除去樣本中的礫石和植物殘根等，混勻、研碎，過2 mm篩，取部分土樣用無菌塑封袋密封，置于0℃以下保溫盒中帶回實驗室用于高通量測序分析。試驗樣地相關信息見表1。

表1 樣本采樣地相關信息

2.2 試劑與儀器

E.Z.N.A.TMMag-Bind Soil DNA Kit（型號為M5635-02），購于Omega Bio-Tek公司；分光光度儀（型號為NanoDrop-ND 1000），購于凱樂博（北京）科技發展有限公司；土壤DNA提取試劑盒購于Omega公司。

2.3 土壤基因組DNA提取及高通量測序

土壤碾碎過80目篩后提取土壤總DNA。利用土壤DNA提取試劑盒提取DNA，然后采用分光光度儀測定提取的DNA濃度，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。將提取質量合格的DNA樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司對細菌16S rRNA V3～V4區進行測序，測序使用Illumina（MiSeq）平臺。

2.4 生物信息學分析

原初數據經質控過濾，得到各樣本有效數據。在97%的相似水平下利用QIIME（v1.8.0)軟件進行物種操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU)的劃分，并進行基于OTU的物種組成分析、Alpha多樣性分析、樣本聚類和樣本間相似性比較及基于COG（Clusters of orthologous groups，直系同源基因群）的功能預測分析等。

2.5 數據的統計與高通量分析

2.5.1 數據的統計

采用Excel 2011軟件和SPSS 19軟件進行數據的統計和分析。

2.5.2 高通量分析用軟件和數據庫

采用RDP數據庫（Release 11.1,http://rdp.cme.msu.edu/）及R（v3.2）、Mothur 1.30.1和UniFrac軟件等進行高通量分析。

3 結果與分析

3.1 測序結果質量分析

每個樣品的有效序列數量測定結果見表2。

通過對6個不同處理的土壤樣品進行Illumina MiSeq高通量測序，根據結果對序列進行統計，每個樣品的有效序列數量結果見表2。原始序列的數目為481 319條，QC后得到優質序列的總數是468 904條，過濾后有效率為96.73%～99.25%。

表2 樣品序列數統計結果

通常在97%的相似水平下對序列進行OTU的聚類，統計獲得全部樣品在不同OTUs中的豐度信息，共產生2 523個OTUs。6個土壤樣品的優質序列長度主要分布在377～379 bp，在378 bp的序列最多為85 553條。

6個處理所含的古菌群落OTUs韋恩圖見圖1。由韋恩圖可知，6個處理共有的OTU為65個，占比為13.18%～20.57%；而每個樣品特有的OTU數量為23～41個，占比相對較低。W2特有的OTU在6個處理中最多，為41，占該樣品總OTU的8.82%；Y1特有的OTU在6個樣品中最少，為23，僅占該樣品總OTU的6.37%。這說明不同處理方式對土壤古菌群落的影響很大；同時還表明，由于處理間與土層異質性增加，為種群的進化和演替提供了更大的可能。

圖1 6個處理土壤古菌群落OTUs韋恩圖

6個樣品基于OTU的樣本聚類樹圖見圖2。樣本聚類樹圖利用樹枝結構能夠更加直觀地反映出多個樣品之間的相似性和差異關系。樹枝的長度代表樣本間的距離，越相似的樣本會越靠近。由圖2可知，Y1與F1的相似性最高，W1與Y1、F1在一個分支上，說明在0～10 cm土層中放牧、刈割和圍封處理方式下，土壤古菌群落均具有較高的相似性；Y2與F2的相似性次之，二者與W2不在一個分支上，W2與Y2、F2的相似性明顯低于W1與Y1、F1的相似性。OTU的樣本聚類樹圖還表明，W2與另外兩個分枝（Y2和F2、Y1和F1）及W1分枝共同聚類在一起。總體分析來看，基本上反映出Y區與F區的古菌群落相似程度高，但與W區的相似程度較低。

圖2 基于OTU的樣本聚類樹圖

3.2 Alpha多樣性分析

3.2.1 基于Alpha多樣性的稀釋曲線

W1、W2、F1、F2、Y1和Y2優質序列分別包含84 447、73 667、80 606、85 553、69 969、74 662條。使用97%相似度的OTU，利用Mothur軟件進行Rarefaction分析，再利用R軟件制作稀釋曲線圖[7]。各個樣本稀釋曲線見圖3。

從圖3中可以看出，序列數目達到400時各種樣品稀釋曲線均趨于平展，表明測序數據量合理，能真實反映土壤樣本中的古菌群落。

圖3 不同區組土壤古菌測序的稀釋曲線

3.2.2 Alpha多樣性指數

Alpha多樣性指數見表3。

表3 6個土壤樣品古菌多樣性指數

由表3可知：各樣本文庫的覆蓋率均為100%，說明土樣中的基因序列能被檢出的概率高，本次測序結果能代表草甸草原土壤古菌群落的實際情況。

根據香濃指數分析，古菌物種的多樣性表現為W2＞F2＞F1＞Y1＞W1＞Y2；在 刈 割 條 件 下，0～10 cm土層物種多樣性則高于10～20 cm土層的。而在圍封和放牧條件下，10～20 cm土層物種多樣性均高于0～10 cm土層的；說明不同處理方式下土壤古菌演替存在不一致性。

基于土層方面，0～10 cm土層物種多樣性表現為F1＞Y1＞W1；10～20 cm土層物種多樣性表現為W2＞F2＞Y2。說明放牧和刈割在促進物種豐度和群落多樣性增加方面具有積極的作用。

根據Chao1指數分析，各處理物種的豐度表現為W2＞F1＞W1＞F2＞Y1＞Y2；在 刈 割 和 放 牧 條 件下，0～10 cm土層物種的豐度均高于10～20 cm土層的，而圍封條件下，10～20 cm土層物種的豐度則高于0～10 cm土層的（W2＞W1）。

基于土層方面，0～10 cm土層物種豐度表現為：放牧＞圍封＞刈割；10～20 cm土層物種豐度表現為：圍封＞放牧＞刈割。

通過表3的綜合數據看來，W2區的古菌群落多樣性和豐富度都最高，因此，圍封對保持物種豐度和群落多樣性具有重要作用。

從不同處理間Alpha指數箱式圖可以看出，樣本內的離散程度，例如從辛普森指數來看樣本之間的離散程度結果見圖4。

從圖4可以看出，F區組的盒子最窄，說明該區內樣本離散程度最小，相比較而言具有較高的保守性；W區組的盒子最寬，說明該區樣本的離散程度最大，W區組的古菌群落相對于F區與Y區保守性較低，結果表明圍封有利于古菌群落多樣性的保護，而重度放牧時古菌群落多樣性則明顯降低。

圖4 處理間Alpha指數箱式圖（辛普森指數）

3.3 土壤樣品古菌群組成分析

從門水平分析群落組成，結果見圖5；從屬水平分析群落組成，結果見圖6。

圖5 門水平所有樣本群落結構分布情況

圖6 屬水平所有樣本群落結構分布圖

從門的分類水平看，6個土壤樣品中共檢測出12個門類，其中奇古菌門（Thaumarchaeota）、廣古菌門（Euryarchaeoya）平均占比分別為78.03%和19.81%，為優勢菌門；烏斯菌門（Woesearchaeota）和疣微菌門（Verrucomicrobia）平均占比分別為1.37%和1.12%，是主要菌門，其他菌門占比均低于1%。

由圖6可知，6個土壤樣品中共檢測到24個屬，其中亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）、產甲烷類球菌屬（Methanomassiliicoccus）平均占比分別為78.03%和19.39%，為優勢屬；烏斯菌AR16屬（Woesearchaeota Incertae SedisAR16）、斯巴桿菌屬（Spartobacteria genera incertae sedis）平均占比超過1%，是土壤古菌

如圖8所示，除了W1與W1這樣的自身交叉區的顏色之外，F1與Y1交叉區的顏色是最深紅的，所以二者古菌群落組成最相似，其次是F2與W2、W1與Y2、W1與Y1、W1與F1、Y1與Y2交叉區的顏色逐漸變淺，說明其間的相似性依次變低；F1與Y2、W2與F2、W2與Y2、W1與W2、F2與F1、F1與F2交叉區的顏色由淺藍依次變為深藍，說明其間的差異性依次遞增。W2與F1、Y1交叉區的顏色最為深藍，所以W2區與F1區、Y1區古菌群落組成差異性最大，相似水平最低。故通過對Unifrac分析結果的聚類發現，F區與Y區的古菌群落相似性高。二者與W區組的古菌群落的相似性低。中的主要群落。

3.4 主成分分析

樣本間的相似度越高則在圖中的位置越聚集，基于OTU的主成分分析（Principal component analysis，PCA）三維圖結果見圖7。

圖7 基于OTU的PCA三維圖

如圖7所示，可以看出PCA1、PCA2和PCA3的樣品差異性貢獻率分別達到93%、4%和2%，合計達到99%，是差異的主要來源，根據各樣本在圖中的位置關系可以看出，F1區與Y1區更加聚集些，所以F1區與Y1區的相似度高，其次為W1和F2。

3.5 樣品間復雜度比較分析

各樣本之間距離關系分析結果見圖8。

圖8 樣品距離熱圖（加權UniFrac的熱圖）

3.6 功能測序分析

樣品中古菌的功能預測結果見圖9。

根據功能測序結果，可觀測各樣品土壤古菌在更高層級水平上的功能。由圖9可以看出，6個樣品在更高層級上的功能主要有25種，其中能量產生與轉換（Energy production and conversion），通用一般功能預測（General function prediction only），復制、重組與修復（Replication,recombination and repair），核苷酸的遷移和代謝（Migration and metabolism of nucleotides），翻譯、核糖體結構和生物發生（Translation,ribosomal structure and biogenesis）以及氨基酸的運輸和代謝（Transport and metabolism of amino acids）等功能在古菌群落中表現明顯。同時由圖9可知，三種處理0～10 cm土層土壤古菌的功能明顯強于10～20 cm土層的，說明0～10 cm土層土壤古菌的代謝活性強于10～20 cm的。F1和Y1、W2和F2及Y2和W1在主要功能和功能強度上具有相似性，說明放牧和刈割對0～10 cm土層古菌的功能影響比較明顯。

圖9 基于COG通路的功能結構分布柱狀圖

4 討論

一般來講，古菌主要分布在極端環境，但在一些非極端環境中均有分布，其分布的生態類型多樣，包括水生態系統[4]、農田土壤[5-6]、放射污染區[7]、重金屬污染區[8]、火山噴發沉積物[9]和陸坡沉積物[10]。研究結果顯示，目前已檢測到包括奇古菌、廣古菌和泉古菌等12個門21個科36個屬。這說明古菌存在的生態環境類型多樣，對各種環境條件具有很好的適應性，以保證各科屬古菌群落的多樣性和物種豐度，同時為研究草地生態系統古菌群落結構和物種多樣性具有重要意義。本次試驗土壤樣本采集地為呼倫貝爾草甸草原腹地，氣候特點為中溫帶半干旱大陸性季風氣候，年降水量為356 mm，降雨主要集中在7—9月份，變動幅度較大；年平均氣溫-2.36℃，最高氣溫36.8℃，最低氣溫-48.1℃。年積溫1 580～1 860℃，無霜期112 d。土壤類型是暗栗鈣土。

土壤理化指標比較均衡[11]，不同處理方式對古菌群落結構和物種多樣性與豐度均有一定的影響。

土壤微生物群落功能多樣性是反映土壤生態系統功能與穩定性的重要指示因子。隨著新一代高通量測序技術的廣泛應用，已成為土壤質量評價的常規方法。但對土壤古菌群落多樣性研究的還相對較少，尤其是對草甸草原土壤中古菌群落特征分析尚未有報道，本研究通過對6個不同處理的研究區的土壤樣品進行Illumina MiSeq高通量測序，根據結果對序列進行統計，得到優質序列468 904條。在97%的相似水平下進行OTU的聚類，以獲得全部樣品在不同OTUs中的豐度信息，共有2 523個OTUs，共有的OTU為65個，占比為13.18%～20.57%。研究區的古菌被分為13個門。但不同生境古菌的群落結構和多樣性方面還存在很大的不同。閆慧貞等[4]利用16S rRNA基因擴增子測序技術，研究了梅山島海域春季浮游古菌群落空間分布情況，結果表明該海域浮游古菌在原核群落中的相對豐度為0.6%～26.5%，浮游古菌群落由奇古菌門Marine GroupⅠ（MGⅠ）和廣古菌門Marine GroupⅡ（MGⅡ）主導，MGⅠ的物種組成較為單一，而MGⅡ的系統發育多樣性較高。張偉等[5]的研究結果表明，新疆干旱半干旱土壤環境下當地原生態土壤古菌群落主要由Thaumarchaeota、SM1K20、Euryarchaeota、Aenigmarchaeota、Crenarchaeota和Marine-HydrothermalVentGroup（MHVG）等6個門組成。雖然各樣品特有OUT相差較大，但各樣品共有的核心OTU數仍高達232個，占主要部分。古菌不僅從參與多種元素的地球化學循環中獲得能量，而且成為數億年地質形成過程中最重要的地質營力，所以地質生態環境的變化必定指示著古菌種群的多樣性差異。

古菌和細菌和真菌一樣，在土壤物質循環轉化和生態系統平衡方面具有非常重要的作用。其作用是通過其各種功能來發揮的。目前在古菌的功能研究中，常用基于COG功能的預測分析，通過對宏基因組預測數據功能分析與對應16S預測功能分析結果的比較，表明該方法對土壤菌群功能分析的準確性接近89%以上，因此該方法能非常好地反映樣本的功能基因構成[12]。本研究顯示6個樣本在更高層級上的功能主要有25種，涉及到能量代謝、核苷酸與核酸代謝、氨基酸和蛋白質代謝、核糖體結構與生物發生、細胞代謝等多方面，表現出其功能的多樣性，這些多樣性的功能與細菌和真菌的功能基本一致[13-18]。表明不同微生物的功能在分子層面上具有同質性。

5 結論

1）基于細菌群落多樣性層面，6個樣本表現為W2＞F2＞F1＞Y1＞W1＞Y2；基于物種豐度層面，6個樣本表現為W2＞F1＞W1＞F2＞Y1＞Y2。

2）基于門和屬層面，6個樣本的優勢菌門、優勢菌屬和其他菌門、菌屬構成相似，但相對豐度存在一定的差異。

3）草原土壤古菌主要功能與細菌、真菌基本一致，說明基于分子層面不同微生物的功能具有同質性。

4）個樣本土壤古菌群落結構與功能相似，具有一定的穩定性。植被類型、處理方式和土層深度等都是影響古菌群落結構和多樣性的因素。