種子萌發期粳稻種質資源耐旱性綜合評價

張娟偉 石亞飛 路旭平 楊文偉 田 蕾 李培富 張振海 羅成科,*

(1 寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2 寧夏農林科學院農作物研究所，寧夏 銀川 750021)

西北干燥區單季稻作區為我國六大稻作區之一，在我國糧食生產中具有不可替代的作用[1]。寧夏引黃灌區是西北干燥區單季稻作區主要稻區之一，該區域熱量充沛、晝夜溫差大，光溫條件好，灌排便利，發展單季稻生產具有得天獨厚的優勢[2]。盡管該區域水稻種植面積較小，但出產的稻米高產優質，已被列為優質粳稻最佳生態區之一[3]。水稻是高需水作物，對水分缺失較為敏感，水分不足會明顯影響水稻的生長發育和產量。水稻生活史的起始階段是萌發期，該時期種子發育的好壞對隨后的成苗效果起著決定作用，以萌發期作為關鍵時期進行水稻種質資源耐旱性鑒定，有助于挖掘水稻耐旱種質資源和培育耐旱品種，對提高作物水分利用效率、保證干旱易發地區稻谷的產量穩定具有重要意義。

聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)作為一種理想的滲透調節劑，被用于模擬干旱脅迫處理水稻種子萌發[4]，耐逆育種工作者往往通過測定脅迫處理后的根、芽有關形態指標，進行水稻萌發期耐旱性鑒定。在進行水稻萌發期或芽期耐旱性鑒定指標的篩選研究中，王賀正等[5]認為相對芽長和相對芽干重與品種的耐旱性緊密相關，這兩個形態指標可以作為鑒定水稻耐旱性的評價指標；李其勇等[6]篩選出儲藏物質轉化率可作為一級耐旱鑒定指標，活力指數和D值為二級耐旱鑒定指標；田又升等[7]分析認為，胚芽干重、發芽率、胚芽鞘長和根冠比均可作為耐旱主要指標；翟榮榮等[8]和袁杰等[9]的研究結果均表明，相對發芽率、相對芽長和相對根長為耐旱鑒定的3個重要指標；敬禮恒等[10]對湖南省內推廣的12個秈稻品種萌發期的耐旱性鑒定結果表明，相對發芽率、相對芽長、相對根長、相對根芽干重和種子萌發耐旱指數均可作為耐旱評價關鍵指標。

本研究結合以上文獻報道，選擇相對發芽勢、相對發芽率、相對芽長、相對根長、相對根芽干重、相對根芽鮮重、活力指數、萌發耐旱指數8個根、芽形態指標進行試驗。首先篩選出水稻萌發期模擬干旱脅迫(PEG-6000)的適宜濃度，然后針對139份不同來源粳稻種質資源進行萌發期耐旱性鑒定。在此基礎上，利用主成分分析法、隸屬函數結合權重分析法對這些種質資源的耐旱性進行綜合評價，以期鑒定出較為理想的耐旱種質，為西北干燥區單季稻作區耐旱新品種選育提供耐旱種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的139份粳稻種質資源主要來源于我國不同省份(103份)，少量來自其他各國，其中法國2份、葡萄牙2份、阿爾巴尼亞1份、南斯拉夫1份、澳大利亞2份、美國1份、巴西1份、孟加拉國1份、韓國4份、朝鮮4份、日本17份，具體信息見表1。

表1 139份粳稻種質資源信息及萌發期耐旱性表現

1.2 試驗方法

試驗前先對各種質資源種子進行42℃預處理 2 d，打破種子休眠，然后挑選均一、飽滿和健康的各種質資源種子150粒(3次重復，每個重復50粒)，用10%次氯酸鈉溶液消毒30 min，蒸餾水沖洗5次后，將其分別接種于含有蒸餾水(對照)和PEG-6000溶液(模擬干旱)浸濕的雙層濾紙培養皿中，置于人工氣候箱中發芽培養。培養條件為28℃光照12 h/26℃黑暗12 h。脅迫處理期間，每天進行不同溶液更換以保證脅迫濃度的穩定性，脅迫處理共8 d。

為了篩選模擬干旱脅迫的PEG-6000溶液的最佳濃度，在前期預備試驗并結合前人報道[11]的基礎上，將寧粳7號、寧粳9號、寧粳36號暫定為萌發期耐旱種質，將寧粳16號、富源4號、長白9號暫定為萌發期旱敏感種質，以這6份種質為供試材料，設置PEG-6000溶液濃度梯度分別為0%、5%、10%、15%、20%進行最佳濃度篩選試驗，獲得的最佳濃度用于139份粳稻種質資源萌發期耐旱性鑒定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 萌發指標測定 以胚根長度與種子等長、胚芽長度為種子長度一半為發芽標準[12],每日定時測定發芽種子數。根據以下公式計算發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、種子萌發指數、萌發耐旱指數：

發芽勢=第4天發芽種子數/供試種子總數

(1)

發芽率=第8天發芽種子數/供試種子總數

(2)

發芽指數=∑(DG/DT)

(3)

式中，DG為逐日發芽種子數，DT為相應DG的發芽天數，計數至第8天。

活力指數=發芽指數×(芽長+根長)

(4)

萌發耐旱指數=水分脅迫下種子萌發指數/對照種子萌發指數

(5)

式中，種子萌發指數=(1.00)nd2+(0.75)nd4+(0.50)nd6+(0.25)nd8，其中nd2、nd4、nd6、nd8分別為第 2、第4、第6、第8天的種子發芽率，1.00、0.75、0.50、0.25 分別為相應萌發天數所賦予的權重系數。

根芽性狀：處理后第8天在各培養皿內隨機選取15粒已發芽的種子，計算各種子的芽長、根長，稱量鮮重后105℃烘箱內殺青0.5 h，80℃烘至恒重后稱量干重。

1.3.2 根、芽相關指數計算方法 針對不同處理，隨機挑取模擬干旱處理后第8天已發芽的種子15粒，分別統計各種子的芽長和根長，以及根和芽的鮮重，稱量鮮重后將它們分別置烘箱內烘干至恒重，稱量根和芽的干重。根據公式計算各指標耐旱系數(drought coefficient，DC)：DC=脅迫指標測定值/對照指標測定值。計算出的相對發芽勢、相對發芽率、相對根長、相對芽長、發芽指數、相對根芽鮮重、相對根芽干重和活力指數均用于后續試驗分析。

1.4 數據統計分析

使用Excel 2010軟件進行數據統計，利用 SPSS 20.0 軟件進行方差分析、相關性分析和主成分分析，利用TBtools軟件進行聚類分析，采用隸屬函數結合權重分析法進行萌發期耐旱性綜合評價。綜合評價過程中用到的隸屬函數值、各指標的權重、綜合耐旱能力D值的具體計算方法和公式見參考文獻[13]。

2 結果與分析

2.1 模擬干旱脅迫PEG-6000最佳濃度篩選

本試驗初步選擇了3個耐旱和3個旱敏感種質，利用不同濃度PEG-6000脅迫6份種質的種子萌發。結果表明，5% PEG-6000對旱敏感種質的發芽影響不明顯，當濃度為10%～20%對旱敏感種質的發芽影響顯著，而對耐旱種質來說，5%～10% PEG-6000對其發芽影響不顯著，當濃度在15%～20%之間時耐旱種質的發芽明顯受到影響。隨著PEG-6000濃度的不斷增加，萌發期耐旱、旱敏種質的大多數耐旱相關指標基本呈現下降趨勢。其中，與低濃度脅迫(5% PEG-6000)相比，15%濃度脅迫下旱敏感種質的大多數耐旱相關指標(相對發芽勢、相對芽長、相對根芽鮮重、相對根芽干重、活力指數、萌發耐旱指數)均存在顯著差異(P<0.05)，耐旱種質中有一半耐旱相關指標(相對根長、相對芽長、相對根芽鮮重、相對根芽干重)存在顯著差異(P<0.05)(表2)。此外，試驗還觀察到，20% PEG-6000濃度嚴重抑制了不同種質的萌發。因此，本研究選擇15% PEG-6000作為種子萌發期粳稻種質資源耐旱性鑒定的最佳濃度。

表2 不同 PEG-6000 濃度下不同種質萌發期耐旱相關指標統計分析

2.2 種子萌發期粳稻種質資源耐旱相關指標分析

利用15% PEG-6000模擬干旱脅迫粳稻種質資源的種子萌發，統計分析8個耐旱相關指標在139份材料間的變異情況，結果表明，耐旱相關指標的變異系數介于13.2%～53.0%之間，變異系數從大到小依次為：活力指數>相對芽長、相對根芽鮮重>相對根長>相對根芽干重>相對發芽勢>萌發耐旱指數>相對發芽率。其中，活力指數在品種間差異最大，變異系數為53%，相對發芽率在品種間差異最小，變異系數為13.2%。除了相對發芽率外，其他耐旱相關指標的變異系數均大于25%(表3)。說明這些指標在139份種質資源之間存在著豐富的變異，可作為重要的粳稻耐旱性篩選指標。

表3 粳稻種質資源萌發期耐旱相關指標分析

2.3 種子萌發期粳稻種質資源耐旱性指標相關性分析

針對萌發期8個耐旱相關指標，如相對發芽勢、相對發芽率、相對根長、相對芽長、相對根芽干重、相對根芽鮮重、萌發耐旱指數和活力指數進行相關性分析。8個耐旱相關指標間均呈極顯著正相關，其中，相對發芽勢與萌發耐旱指數、相對發芽勢與相對發芽率、活力指數與萌發耐旱指數、相對發芽率與萌發耐旱指數、相對根長與活力指數、相對芽長與活力指數，兩兩指標之間的相關系數均達到0.6以上(表4)，說明這些指標的變化趨勢具有一致性。

表4 粳稻種質資源萌發期耐旱指標間的相關性分析

2.4 種子萌發期粳稻種質資源耐旱性主成分分析

本研究對萌發期 8個耐旱相關指標進行了主成分分析，結果如表5所示。CI1、CI2、CI3、CI44個主成分的特征值分別為4.190、1.246、0.743和0.619，均大于0.6，累計貢獻率達到84.963%，能充分概括大多數指標，符合指標選擇的原則[14]，因而提取這4個主成分進行分析。在主成分1中，相對發芽勢、相對芽長、活力指數和萌發耐旱指數的載荷值較高，均在0.73以上，這4個指標是該主成分的主要作用因子。在主成分2中，相對發芽率、相對發芽勢的載荷絕對值分別是0.495和0.487，這兩個指標為該主成分的主要作用因子。而在主成分3中，僅有相對根芽鮮重表現出較高的載荷值(0.738)，可以作為該主成分的作用因子。在主成分4中，相對根芽干重的載荷絕對值也表現的較高(0.556)，能夠作為該主成分的作用因子。綜合考慮，將相對發芽勢、相對芽長、活力指數及萌發耐旱指數4個指標作為種子萌發期粳稻種質資源耐旱性評價的關鍵指標。

表5 主成分貢獻率及特征向量

2.5 種子萌發期粳稻種質資源耐旱性綜合評價

利用139份粳稻種質資源萌發期耐旱性的綜合指標值(CI1～CI4)分別計算隸屬函數值。根據萌發期各綜合指標貢獻率的大小，依次求出4個綜合指標的權重，分別為0.616、0.183、0.109和0.091。用上述4個隸屬函數值與權重的乘積并累加得到綜合評價值(D)，并根據D值對139份粳稻種質資源萌發期的耐旱性進行排序(表1)。

由結果可知，139份粳稻種質D值范圍介于0.109～0.891之間，其中，D≥0.81的種質有No.128(松粳3號)、No.127(通院515)、No.129(龍粳807)、No.44(松粳20)、No.11(Farry)，可以將上述種質視為萌發期耐旱能力強的種質資源；D值≤0.19的種質資源有No.35(京引58)、No.31(Calrose)、No.93(寧大15149)、No.66(新稻10號)、No.102(山形86)。D值在一定程度上能夠客觀反映出種子萌發期各粳稻種質資源耐旱性的強弱。一般而言，D值越大，耐旱性越強。因此，本研究認為上述種質為萌發期耐旱能力弱的種質資源。

2.6 種子萌發期粳稻種質資源耐旱性相關指標的聚類分析

根據D值大小將139份粳稻種質資源分成三種類型，分別為耐旱種質(0.698

圖1 基于4個萌發期耐旱關鍵指標及D值的139份粳稻種質資源聚類圖

2.7 種子萌發期粳稻種質資源耐旱性地域差異比較

139份粳稻種質資源廣泛分布于歐美、日韓、中國。為了進一步分析這些粳稻種質資源萌發期的耐旱性是否存在地域差異，對萌發期耐旱性4個關鍵指標分別進行地域差異顯著性分析。結果表明，來自歐美的種質資源的相對發芽勢、相對芽長及萌發耐旱指數均顯著低于日韓和中國(P<0.05)，種質資源表現為旱敏感表型；日韓種質資源的相對發芽勢、相對芽長、萌發耐旱指數和D值與中國無顯著差異(P>0.05)，這兩種地域的種質資源均表現為中等耐旱表型(表6)。

表6 不同區域粳稻種質資源萌發期耐旱性差異比較

進一步對來源于我國不同稻作區的種質資源進行耐旱性差異分析，結果表明不同稻作區的種質資源的耐旱關鍵指標、D值差異不顯著(P>0.05)，總體表現出中等耐旱表型(表7)，種子萌發期不同稻作區種質資源耐旱性無明顯地域差異，不同稻作區個別種質資源表現出的明顯表型差異可能與其所屬地的特殊氣候、地貌特征、地理位置等自然生態條件相關。

表7 不同稻作區粳稻種質資源萌發期耐旱性差異比較

3 討論

3.1 種子萌發期粳稻種質PEG-6000濃度的篩選

PEG-6000是一種理想的滲透調節劑，其通過調節溶液的滲透壓進而限制水分進入種子，從而影響水稻種子的萌發，以達到水分脅迫的目的[15]，PEG-6000已被廣泛用于萌發期水稻耐旱資源的篩選與評價[16-18]。由于水稻類型、水稻品種、種子處理方法和培養條件的不同，篩選得到的PEG-6000濃度也有所不同。彭朝才等[19]和李其勇等[6]利用不同濃度PEG-6000分別對貴州和四川秈稻進行芽期和萌發期干旱脅迫處理，表明PEG-6000的最適濃度為20%，而旱稻芽期干旱脅迫的最佳PEG-6000處理濃度為12.5%[20]。對于粳稻而言，成熟期不同，萌發期耐旱性篩選的適宜濃度也不同，翟榮榮等[8]認為25% PEG-6000是浙江晚粳稻芽期耐旱性篩選的適宜濃度；袁杰等[9]認為，新疆早粳稻萌發期耐旱性篩選的適宜濃度為20%，而田又升等[7]認為適宜濃度為15%。本研究利用不同濃度PEG-6000模擬干旱脅迫6份粳稻種質資源，發現5% PEG-6000嚴重抑制旱敏感種質和耐旱種質種子萌發的影響差異不顯著，10% PEG-6000對兩種不同類型種質種子萌發的影響不一致，20% PEG-6000嚴重抑制旱敏感種質種子萌發，無法對比鑒定不同類型種質，15% PEG-6000能夠明顯區分種子萌發期不同粳稻種質耐旱性差異。因此，本研究認為15% PEG-6000可作為篩選鑒定種子萌發期粳稻種質資源耐旱性的最適濃度，這與田又升等[7]的研究結論一致。

3.2 種子萌發期粳稻種質耐旱性鑒定指標的選擇

萌發期、苗期和孕穗期是水稻生長中最為敏感的3個時期，萌發期是水稻群體數量建成的關鍵時期, 易受干旱脅迫的影響[21-22]。由于萌發期耐旱性鑒定具有脅迫用時短、易于重復、試驗條件穩定、適合大批量材料鑒定等優點，因而用PEG-6000模擬干旱條件進行萌發期耐旱性鑒定較為適宜。前人針對水稻、糜子、綠豆、豌豆等不同作物萌發期耐旱性鑒定與評價開展了大量的研究，常選用發芽率、根長、芽長、萌發耐旱指數、活力指數等指標或相對值作為耐旱關鍵指標[23-26]。對水稻，不同研究者所選用的耐旱鑒定指標不同，李其勇等[6]采用儲藏物質轉化率作為耐旱鑒定一級指標，活力指數為耐旱鑒定二級指標；楊瑰麗等[27]選擇芽鞘長和最長根長2個指標、王賀正等[5]選用相對芽長和相對芽干重2個指標分別作為耐旱性鑒定指標；翟榮榮等[8]和袁杰等[9]認為相對發芽率、相對芽長和相對根長是耐旱鑒定的3個關鍵指標，田又升等[7]選擇了胚芽干重、發芽率、胚芽鞘長和根冠比為耐旱鑒定4個指標；敬禮恒等[10]在水稻萌發期耐旱鑒定中選用了更多的耐旱指標，包括相對發芽率、相對芽長、相對根長、相對根芽干重和種子萌發耐旱指數等。本研究在8個耐旱相關指標的基礎上，通過主成分分析法確定了相對發芽勢、相對芽長、活力指數、萌發耐旱指數4個指標作為耐旱鑒定關鍵指標，適合大量種質萌發期耐旱性鑒定，這與李其勇等[6]的研究結論較一致。

3.3 種子萌發期粳稻種質資源耐旱性綜合評價

耐旱性是一個復雜的數量性狀，僅利用單項耐旱指標評價種子萌發期水稻種質資源耐旱性存在局限性[28]，宜采用多項指標對不同種質的耐旱性進行綜合評價，從而保證結果的準確性和科學性[29]。在多數研究中，由于相對發芽勢、相對發芽率、相對芽長、發芽指數、活力指數等生長指標能夠比較全面地反映出種質的萌發及生長狀態，因而在作物萌發期耐旱性綜合評價中被廣泛采用[30-32]。本研究選用相對發芽勢、相對發芽率、相對根長、相對芽長、相對根芽干重、相對根芽鮮重、萌發耐旱指數和活力指數8個指標進行測定。發現8個指標兩兩之間均存在極顯著相關性，在此基礎上利用主成分分析將8個指標轉化為4個彼此獨立的新指標，結合隸屬函數值與權重的乘積并累加得到各種質耐旱性的綜合評價D值，利用該指標將139份粳稻種質資源劃分為耐旱、中等耐旱和旱敏感3種類型，準確地評價了這些資源的耐旱性，這與趙愉風等[33]對豌豆耐旱性評價結果相似。聚類分析是根據變量的數值特征變化對研究對象進行分類的一種多元統計分析方法，具有較高的可靠性[34]。本研究在耐旱性綜合評價的基礎上，以相對發芽勢、相對芽長、萌發耐旱指數和活力指數4個關鍵指標數值為依據進行聚類分析，以D值作為參考，將139份粳稻種質材料分成4個亞群。其中，亞群Ⅰ為典型旱敏感亞群，亞群Ⅱ為耐旱亞群，亞群Ⅲ被視為旱敏感亞群(除6份中等耐旱種質外)，亞群Ⅳ被視為中等耐旱亞群。從聚類圖(圖1)中可以清楚地看出，活力指數與D值表現出較好的一致性，說明在種質資源聚類分析時，4個耐旱關鍵指標中的活力指數起著關鍵作用，與前人研究結果一致[35-38]。

3.4 粳稻耐旱種質資源的挖掘與利用策略

水稻育種的重要物質基礎是種質資源，由于不同的地理、生態環境以及長期的種植制度等因素，形成了遍布全球的不同類型種質資源。水稻種質資源中蘊藏著豐富的自然變異，篩選水稻耐旱種質資源有望挖掘耐旱基因，為培育耐旱品種提供基因資源。Vivek等[39]利用分子標記對不同秈稻品種進行遺傳多樣性分析，發現在不同品種間存在著廣泛的耐旱優異等位變異，進而篩選鑒定出Norungan和TK-M1 2個耐旱品系。Yusaku等[40]從菲律賓干旱高地品種KinandangPatong中獲得了一個深根基因DRO1，將其導入到水稻栽培品種IR64中，培育出具有明顯耐旱性的Dro1轉基因水稻。Vanniarajan等[41]利用簡單重復序列(simple sequence repeat, SSR)標記對印度地方品種、秈稻和粳稻進行了遺傳多樣性分析，發現很多耐旱的有利等位變異多分布在粳稻品種和地方品種中。本研究從139份粳稻種質資源中均鑒定出耐旱性強的地方品種，如Farry、Hangarlan No.1、Bertone、Galhardo和Daniela，這些種質資源中均可能蘊藏著耐旱性狀相關的優異等位變異，但仍需要進一步挖掘，其相應的耐旱分子標記的開發與利用也有待深入研究。

與其他稻作區相比，西北干燥區單季稻作區具有光熱充沛、晝夜溫差大和氣候干燥等優勢條件，使該區域生產的稻米高產優質具有較好的市場前景，但現今水資源供給不足已明顯地限制了西北早粳稻生產的規模。本研究篩選鑒定到耐旱種質寧粳36號和2012-441，中等耐旱種質寧粳50號、寧粳51號、寧粳53號、寧粳39號和08GM38，其均為近年來新育成品種(系)，表現出較優的豐產性和穩產性；寧粳36號和寧粳50號還表現出品質優良的特性，分別達到國家1級和2級標準[42]，寧粳51號和寧粳53號的生育期還表現出中早熟性狀[43]。因而，在適應現階段西北干燥區種植業結構調整和發展節水農業的大背景下，建議以這些耐旱品種為育種親本材料，培育多耐高產優質的早粳稻聚合體，研發適于干燥氣候條件下的早粳稻直播技術，以保證西北干燥區稻谷的產量穩定。

4 結論

本研究表明模擬干旱脅迫(PEG-6000)的最佳濃度為15%，利用8個耐旱指標綜合評價了種子萌發期粳稻種質資源，確定了相對發芽勢、相對芽長、活力指數、萌發耐旱指數為4個關鍵指標，采用D值結合聚類分析，將139份粳稻種質資源劃分為耐旱種質(0.698