烏賊墨黑色素納米粒對明膠-普魯蘭多糖復合膜的性能影響及表征

劉蘇婷 宋詩軍 方旭波 陳小娥,* 張海龍 馬宇喬

(1 浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2 浙江國際海運職業(yè)技術(shù)學院，浙江 舟山 316021；3 舟山新諾佳生物工程有限公司，浙江 舟山 316000；4 浙江海洋大學石油化工與環(huán)境學院/臨港石油天然氣儲運技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 舟山 316022)

隨著人們對食品安全和環(huán)保問題的日益重視，傳統(tǒng)塑料包裝所造成的環(huán)境污染引起了廣泛關注，因此開發(fā)可降解、可食性的生物聚合物薄膜材料已成為食品包裝領域的研究熱點[1]。此類薄膜材料的成膜基質(zhì)主要為蛋白質(zhì)、脂類、多糖及這些生物聚合物的復合物[2]。其中，明膠是最常用的生物聚合物之一，其主要成分是蛋白質(zhì)，具有良好的成膜性和生物相容性。明膠膜的機械性能較高，但其阻隔性能較差，因此需要與其他聚合物共混以提高其綜合物理性能[3]。普魯蘭多糖是一種由出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的胞外線性多糖，該糖由重復的麥芽三糖單元聚合而成，水溶性及生物相容性好，以其為原料制備的膜具有良好的阻油性和阻氧性，但機械性能相對較差[4-5]。明膠與普魯蘭多糖間共混能改善單一組分膜的綜合性能。如徐幸等[6]研究發(fā)現(xiàn)明膠與普魯蘭多糖分子間具有良好的相容性，兩者共混制備的膜機械性能較高、水蒸氣透過率(water vapor permeability，WVP)較低；高丹丹等[7]發(fā)現(xiàn)，在明膠膜中添加普魯蘭多糖能提高明膠膜的抗拉強度并改善其阻隔性能。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米復合法也被廣泛用于改善可食性膜的物化性能。近年來，天然納米填料越來越受到國內(nèi)外學者的關注。其中，烏賊墨黑色素是一種極具潛力的天然納米填料，具有抗菌、防輻射等生物活性及可生物降解性，其抗氧化作用也已被國內(nèi)外研究廣泛證實[8-9]。烏賊墨黑色素的分子結(jié)構(gòu)中存在許多反應性官能團(-OH、-NH和-COOH)，它們與聚合物基質(zhì)之間的強氫鍵相互作用能改善聚合物的綜合性能[10]。但未經(jīng)處理的烏賊墨黑色素水溶性和粒徑均勻性較差[11]。浙江海洋大學水產(chǎn)食品化學課題組前期采用高壓微射流技術(shù)手段將烏賊墨黑色素制備成烏賊墨黑色素納米粒(melanin nanoparticles，MNP)，發(fā)現(xiàn)不僅能使烏賊墨黑色素的粒徑更小，還能有效改善黑色素的水溶性、粒徑均勻性等物理特性，且在120 MPa高壓微射流條件下制得的MNP平均粒徑最小，為101.20 nm[12]。Roy等[13-14]在果膠/瓊脂復合膜以及納米纖維基復合膜中添加了MNP，發(fā)現(xiàn)所制備的復合膜不僅機械性能優(yōu)良，還具有較強的抗氧化性和紫外阻隔性。目前，關于烏賊墨黑色素物化特性、生物活性的研究較多，但對于MNP對明膠-普魯蘭多糖(gelatin/pullulan，Gel/Pul)膜物化特性及抗氧化性能影響的研究尚鮮見報道。

本研究通過將高壓微射流技術(shù)制備的MNP添加到Gel/Pul成膜基質(zhì)中，評估MNP對Gel/Pul基復合膜物化特性的影響，探究不同MNP添加量對納米復合膜的水蒸氣透過率、透油率、機械強度、光學性能和抗氧化性能的影響，并通過掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)、傅立葉變換紅外光譜(fourier transform infrared reflection, FTIR)對納米復合膜進行表征，分析MNP與成膜基質(zhì)間的相互作用，旨在為MNP應用于可食性包裝膜研究提供理論和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍虎斑烏賊墨囊，陜西好時鮮海洋生物科技有限公司；普魯蘭多糖，河北鴻韜生物工程有限公司；堿性蛋白酶(200 000 U·g-1)，南寧龐博生物工程有限公司；魚油，舟山新諾佳生物工程有限公司；明膠、甘油等均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

AMH-3高壓微射流均質(zhì)機，安拓思納米技術(shù)(蘇州)有限公司；JIDI-6 D低速大容量離心機，廣州吉迪儀器有限公司；FA25-20DG均質(zhì)機，上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；GJ-10冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；C-MAG HS 4磁力攪拌器，上海子期實驗設備有限公司；HH-4 D數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；YNK/TH-100 L恒溫恒濕試驗箱，蘇州優(yōu)尼克環(huán)境試驗設備有限公司；293-821-30數(shù)顯外徑千分尺，蘇州量子儀器有限公司；UV-5900紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；XLW(B)電子萬能拉伸實驗機，濟南藍光機電技術(shù)有限公司；EM-30掃描電子顯微鏡，韓國COXEM有限公司；iCAN9傅里葉紅外光譜儀，天津鵬普科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 MNP的制備 參照李萍等[12]的方法，從解凍好的烏賊墨囊中擠出烏賊墨汁，加入等體積去離子水浸泡過夜，8 000 r·min-1離心15 min，得到黑色素沉淀。以固液比1∶50(v/v)向沉淀中加入去離子水，調(diào)節(jié)pH值為10.5，加入4 200 U·g-1的堿性蛋白酶，50℃酶解4 h后于100℃沸水浴中滅酶活15 min。將酶解后的烏賊墨汁經(jīng)120 MPa高壓微射流處理制成納米烏賊墨汁，冷凍干燥后即獲得MNP。

1.3.2 烏賊墨納米復合膜的制備 稱取10 g明膠、4 g普魯蘭多糖和3 g甘油，加入300 mL去離子水，在90℃下磁力攪拌30 min，然后分別將不同添加量的MNP[0、0.5、1.0、1.5和2.0 wt%(占明膠和普魯蘭多糖總質(zhì)量的百分比)]添加到上述溶液中，繼續(xù)在90℃下磁力攪拌20 min。膜液置于真空脫氣泵中脫氣30 min后取40 mL均勻倒入玻璃培養(yǎng)皿中，于40℃下干燥過夜成膜。將剝離的膜在溫度25℃和相對濕度50%下至少放置48 h，以確保在后續(xù)試驗中樣品水分正常化。每種濃度制備5個樣品，用于后續(xù)試驗。

1.3.3 膜厚度測定 用千分尺在每個膜樣品上隨機選取10個點，測定其厚度，取平均值，單位為μm。

1.3.4 水分含量 將10 mm×40 mm的膜置于105℃的鼓風干燥箱中干燥至恒重。按公式(1)計算膜的水分含量(moisture content，MC)：

MC=(m-m0)/m×100%

(1)

式中，m0為膜干燥前的質(zhì)量，g；m為膜干燥后的質(zhì)量，g。

1.3.5 WVP測定 將5 g干燥的無水氯化鈣放入稱量皿中，用薄膜樣品覆蓋皿口并密封，然后將稱量皿置于含去離子水的干燥器中，每隔24 h，對稱量皿進行稱重，直至前后兩次質(zhì)量差不大于5%。按公式(2)計算WVP，單位為g·mm·m-2·h-1·kPa-1。

WVP=ΔM×t/(ΔP×S×ΔT)

(2)

式中，ΔM為稱量皿的質(zhì)量差，g；t為薄膜厚度，mm；S為薄膜的覆蓋面積，m2；ΔT為時間間隔，h；ΔP為薄膜兩側(cè)的水蒸氣壓差，kPa，本試驗取ΔP為3.167 kPa。

1.3.6 透油率測定 在試管中加入5 mL魚油，用薄膜樣品封口并倒置于濾紙上，于25℃、58%相對濕度的條件下，在干燥器中放置24 h，稱量濾紙的質(zhì)量變化。按公式(3)計算透油率，單位為g·mm·cm-2·d-1。

透油率=ΔW×t/(S×T)

(3)

式中，ΔW為濾紙質(zhì)量差，g；t為薄膜厚度，mm；S為透油面積，cm2；T為放置時間，d。

1.3.7 透光率及不透明度 根據(jù)Hosseini等[15]的方法，將10 mm×40 mm 薄膜貼于比色皿一側(cè)，以空白比色皿作為對照，測定薄膜在200～800 nm波長范圍內(nèi)的透光率，確定薄膜對光的阻隔性能；測定薄膜在600 nm波長處的透光率，按公式(4)計算膜的不透明度。不透明度值越大，膜的透明度越小。

不透明度=-lgT600/t

(4)

式中，T600為膜在600 nm處的透光率；t為薄膜厚度，mm。

1.3.8 機械性能 將薄膜切割成10 mm×50 mm的矩形條，使用電子萬能拉伸實驗機測定其抗拉強度(tensile strength，TS)和斷裂伸長率(elongation at break，EB)，初始距離設為40 mm，測試速度設定為1 mm·s-1。

TS= F/S

(5)

EB=(L-L0)/L0×100%

(6)

式中，TS為抗拉強度，MPa；F為薄膜斷裂時的最大拉力，N；S為薄膜的橫截面面積，m2；EB為斷裂伸長率，%；L0為薄膜的原始長度，mm；L為薄膜斷裂時的長度，mm。

1.3.9 抗氧化活性的測定 將薄膜樣品用去離子水復溶后制成20 mg·mL-1的薄膜樣品溶液，進一步分析鐵離子還原能力和DPPH自由基清除能力。

1.3.9.1 鐵離子還原能力 根據(jù)趙巖巖等[16]的方法，將2 mL樣品溶液與2 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1，pH值6.6)和2 mL鐵氰化鉀(1%，w/v)溶液混合，于50℃加熱0.5 h，冷卻后加入2 mL三氯乙酸溶液(10%，w/v)，混勻后以3 000 r·min-1離心10 min，取出2 mL上清液，加入2 mL去離子水和0.4 mL氯化鐵溶液(0.1%，w/v)，充分混合。反應10 min后，以去離子水為參考，于700 nm處測定吸光度值(A700)。A700值越高，表明樣品的鐵離子還原能力越強。

1.3.9.2 DPPH自由基清除率 以95%乙醇為溶劑，配制DPPH溶液(10%，w/v)。將3 mL DPPH溶液與1 mL薄膜樣品溶液充分混合，室溫避光靜置30 min，于517 nm處測定吸光度(A1)。再用95%乙醇分別代替上述體系中的樣品溶液和DPPH溶液，作為對照組和空白組，測定對照吸光度(A2)和空白吸光度(A3)。按公式(7)計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A3]×100%

(7)

1.3.10 FTIR分析 用傅里葉紅外光譜儀(FTIR)分別采集MNP以及復合膜樣品在550～4 000 cm-1范圍內(nèi)的FTIR圖譜。復合膜的FTIR圖在衰減全反射模式下采集，掃描次數(shù)為32，分辨率為4 cm-1。

1.3.11 SEM觀察 用掃描電子顯微鏡(SEM)在20 kV加速電壓下觀察復合膜的形貌。在SEM分析之前，使用真空濺射鍍膜機對樣品進行鍍金。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0和Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差來表示，并使用方差分析(analysis of variance，ANOVA)對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MNP添加量對膜的厚度、WVP和MC的影響

由表1可知，未添加MNP的Gel/Pul膜的厚度為125.07 μm，隨著MNP添加量的增加，納米復合膜的厚度略有增加，最高達133.07 μm，這主要是復合薄膜中固體含量的增加所致。食品中的水分含量(MC)與其水分吸附能力密切相關，隨著MNP添加量的增加，復合膜的MC逐漸降低，但相鄰梯度間差異不顯著(P>0.05)。當MNP添加量達到2.0 wt%時，納米復合膜的MC從12.69%降至11.51%，顯著低于純Gel/Pul膜(P<0.05)。較低的MC一定程度上反映納米粒與復合膜的親水位點存在相互作用，從而減少與水的相互作用[17]。WVP是影響產(chǎn)品貨架期的重要因素之一。降低膜的WVP能減緩食品與環(huán)境中水分交換速率，延長貨架期[18]。Gel/Pul膜的WVP為0.305 g·mm·m-2·h-1·kPa-1，加入MNP后WVP呈先減小后增大的趨勢，當MNP添加量為1.0 wt% 時，達到最低值0.281 g·mm·m-2·h-1·kPa-1，這表明添加適量的MNP有利于降低復合膜的WVP。

2.2 透油率

由表1可知，添加MNP后復合膜的透油率未發(fā)生變化，均為零。這可能是因為明膠和普魯蘭多糖具有親水性，以此為基質(zhì)制備的復合膜也展現(xiàn)出親水性，而魚油作為疏水性物質(zhì)，與其不相溶，故油脂在復合膜中無法滲透[19]。綜上，本研究制備的納米復合膜具有良好的阻油性，可用于包裝魚油等高脂產(chǎn)品[20]。

表1 MNP添加量對Gel/Pul膜厚度、WVP和MC的影響

2.3 透光率及不透明度分析

薄膜的光學性質(zhì)對其外觀、應用以及銷售影響較大。本研究評估了納米復合薄膜的透光率及不透明度，結(jié)果如表2所示。未添加MNP時，在250～280 nm的紫外區(qū)，Gel/Pul膜的透光率在1.26%～5.30%范圍內(nèi)，在350～800 nm的可見光區(qū)，Gel/Pul膜的透光率在58.07%～91.30%范圍內(nèi)。添加MNP后，納米復合膜的透光率隨MNP添加量的增加而明顯降低，表明MNP能增強復合膜的光阻隔性能，使復合膜具有優(yōu)越的紫外阻隔性。薄膜的不透明度值越高，表明其透明度越低。隨著MNP添加量的增加，復合膜的不透明度值逐漸增大，透明度呈現(xiàn)下降的趨勢。

表2 MNP添加量對Gel/Pul膜透光率和不透明度的影響

2.4 機械性能

由圖1可知，隨著MNP添加量的增加，納米復合膜的TS呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當MNP添加量為1.0 wt%時，納米復合膜的TS達到最大值，與未添加MNP的復合膜相比顯著增加了83.02%(P<0.05)。當MNP添加量超過1.0 wt%，納米復合膜的TS反而持續(xù)降低，說明添加適量的MNP能夠提高復合膜的TS，MNP對Gel/Pul膜具有一定的增強效果。另一方面，納米復合薄膜的EB隨MNP添加量的增加而略微降低，原因可能是MNP和成膜基質(zhì)之間產(chǎn)生了氫鍵作用，促使拉伸阻力增大，導致復合膜的剛性增加、柔韌性降低。

注：不同小寫字母表示同一指標不同MNP添加量之間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.5 抗氧化活性

由圖2可知，未添加MNP的Gel/Pul膜也展現(xiàn)出抗氧化活性，這是因為明膠和普魯蘭多糖本身具有一定量的抗氧化活性[21-22]。隨著MNP添加量從0增加到2.0 wt%，復合膜的抗氧化活性顯著增強(P<0.05)，DPPH自由基清除率從10.22%增加到64.51%，鐵離子還原能力從0.181 7增加到0.692 7；當復合膜中MNP的添加量達2.0 wt%時，兩者均顯示出最強的抗氧化活性。

圖2 MNP添加量對Gel/Pul膜抗氧化活性的影響

2.6 FTIR光譜分析

由圖3可知。未添加MNP的Gel/Pul膜中，3 278.39 和2 913.91 cm-1處的吸收峰分別對應于-OH、N-H的伸縮振動和明膠脂肪族側(cè)鏈的C-H伸縮振動[23-24]。1 631.48 cm-1處典型的酰胺I區(qū)峰則與C=O拉伸振動有關，1 542 cm-1處的峰是酰胺II區(qū)N-H和C-N的伸縮振動[25]。1 238.08 cm-1附近的吸收峰為酰胺Ⅲ區(qū)C-N和N-H的伸縮振動峰[26]。這些吸收峰都是明膠和普魯蘭多糖吸收峰的疊加。在1 029.80 cm-1處的特征峰是甘油中-OH的伸縮振動[27]。加入1.0 wt%和2.0 wt% MNP后，未觀察到明顯的官能團變化，這表明MNP與Gel/Pul基質(zhì)間未發(fā)生化學變化，但吸收峰的峰位和強度略有變化，是因為MNP與Gel/Pul基質(zhì)間存在分子間氫鍵的相互作用[28]。

圖3 MNP和納米復合膜的FTIR光譜

2.7 SEM分析

為探究MNP在Gel/Pul基質(zhì)中的分散狀態(tài)，利用SEM觀察了納米復合膜的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)，如圖4所示。在Gel/Pul膜中可以觀察到表面整體平整，但存在少量褶皺，含MNP的納米復合膜表面光滑連續(xù)，不存在紋路和裂隙，MNP均勻分布在Gel/Pul基質(zhì)中，且沒有出現(xiàn)分離的相，說明MNP與Gel/Pul基質(zhì)具有良好的相容性。這一結(jié)果與其他學者制備的含MNP的復合膜SEM形貌類似[29-30]。究其原因，可能是MNP與Gel/Pul基質(zhì)間相互作用形成氫鍵，形成了致密的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，這與FTIR的研究結(jié)果一致。分子間的相互作用，宏觀上可表現(xiàn)為機械性能上的改變，微觀上則表現(xiàn)為復合膜微觀結(jié)構(gòu)的區(qū)別，這也解釋了在MNP添加量為0 wt%～1.0 wt%范圍內(nèi)TS逐漸增大、WVP降低的原因[31]。此外，當MNP添加量增大到1.5 wt%，可觀察到納米粒的少量聚集，MNP添加量為2.0 wt%時，更多的納米粒發(fā)生聚集，這也導致了水蒸氣的擴散增強，與表1中WVP的變化趨勢一致。

注：a～e：MNP添加量分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 wt%。

3 討論

WVP是判斷復合膜對水蒸氣等滲透物阻隔性能的重要指標之一。WVP越低越有利于延長食品貯藏期[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著MNP添加量的增加，WVP呈先減小后增大的趨勢，當MNP添加量為1.0 wt%時，WVP最低。究其原因，可能是由于在0～1.0 wt%的添加范圍內(nèi)，分散的MNP作為納米填料，能夠填補薄膜內(nèi)的自由體積，使膜內(nèi)部的孔隙率減少，形成曲折的擴散路徑，阻礙了水分子的通過[33]。此外，MNP與聚合物基質(zhì)相互作用形成了氫鍵，對WVP也有一定影響，因此WVP呈現(xiàn)下降趨勢。當MNP添加量超過1.0 wt%時，WVP增大，這是因為MNP發(fā)生了顆粒聚集，納米粒與聚合物基質(zhì)界面處會形成微孔，導致薄膜結(jié)構(gòu)中的空隙變大，使水蒸氣在膜中的擴散路徑不再曲折[34]，這與SEM觀察結(jié)果一致。劉飛[35]在研究添加殼聚糖納米粒對復合明膠膜的影響時也發(fā)現(xiàn)WVP具有類似的趨勢。

另一方面，復合膜的光阻隔性能均隨MNP添加量的增加而明顯提高。這是因為分散在聚合物基質(zhì)中的納米粒通常具有光阻隔性能[36]，而MNP能夠吸收大多數(shù)可見光、紫外光以及一些低能輻射，表現(xiàn)出優(yōu)異的紫外阻隔性能。據(jù)Roy等[14]報道，MNP對納米纖維素復合材料光學性能的影響與本研究結(jié)果相類似。由于紫外光會導致食品的劣變，尤其是脂質(zhì)的氧化，因此復合膜紫外阻隔性能的提高能有效延緩脂質(zhì)的氧化變質(zhì)。

隨著MNP的加入，復合膜的TS呈先增加后減小的趨勢。這是由于MNP和Gel/Pul基質(zhì)中的氫受體間存在氫鍵和范德華力，使得復合膜的結(jié)構(gòu)更加致密，進而使TS增加。當MNP添加量繼續(xù)提高時，TS的下降是由于過多的MNP在Gel/Pul膜中分散性變差，發(fā)生少量顆粒聚集，從而減少了聚合物基質(zhì)與MNP之間的相互作用[37]。添加MNP后，復合膜的EB略有下降，Shankar等[28]研究也發(fā)現(xiàn)MNP的添加降低了明膠膜的EB。而Roy等[14]研究發(fā)現(xiàn)，隨著MNP添加量的增加，納米纖維素復合薄膜的EB先增加后減小，與本研究結(jié)果不一致，這一差異與黑色素納米粒及成膜基質(zhì)的種類和含量有關。由此可見，MNP與不同種類的成膜基質(zhì)間可能存在不同的相互作用，有待進一步深入研究。

隨著MNP添加量的增加，納米復合膜的DPPH自由基清除率和鐵離子還原能力均不斷增大，表明MNP能顯著(P<0.05)提高復合膜的抗氧化活性。Shankar等[28]在明膠基薄膜中添加1 wt% MNP后，發(fā)現(xiàn)薄膜的DPPH自由基清除率等抗氧化活性顯著提高。Roy等[29]在卡拉膠基薄膜中添加MNP后也得出了類似的結(jié)果。這是因為MNP分子中的非共價電子很容易與自由基和其他活性物質(zhì)相互作用，從而表現(xiàn)出較強的抗氧化能力[38]。另一方面，Moradi等[39]發(fā)現(xiàn)可食性薄膜的抗氧化能力與抗氧化活性成分的添加量成正比，因此MNP添加量越大，復合膜的抗氧化活性越高。

FTIR光譜圖結(jié)果顯示，添加MNP后，納米復合膜特征吸收峰的峰位和強度略有變化，如3 278.39 cm-1處對應于-OH、N-H的伸縮振動峰強度有所降低且峰位略偏移，2 913.91 cm-1處對應于C-H的伸縮振動峰也發(fā)生了類似變化。Yang等[40]在海藻酸鈉/聚乙烯醇復合膜中添加MNP后，發(fā)現(xiàn)復合膜的特征吸收峰峰位也發(fā)生了偏移，吸收峰的強度變?nèi)酰c本研究結(jié)果相類似。Roy等[14]研究MNP對殼聚糖膜FTIR圖譜的影響時也觀察到了類似的變化，同時指出，這是由于MNP與成膜基質(zhì)之間存在分子間氫鍵的相互作用。

綜上所述，添加MNP不僅可以提升Gel/Pul基復合膜的抗氧化活性和紫外阻隔性，而且可改善復合膜的機械性能和水蒸氣阻隔性能。但本研究僅初步探究了MNP添加量對Gel/Pul復合膜結(jié)構(gòu)和性能的影響，下一步還需重點研究復合膜在魚油等高脂食品包裝中的實際應用效果。

4 結(jié)論

本研究將高壓微射流處理得到的MNP以不同的添加量添加到Gel/Pul成膜基質(zhì)中，考察了復合膜的WVP、透油率、機械性能、光學性能、DPPH自由基清除率等指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當MNP添加量為1.0 wt%時，復合膜具有最佳的機械性能和水蒸氣阻隔性，同時復合膜也展現(xiàn)出優(yōu)越的紫外阻隔性和抗氧化性能。綜上，MNP能提高復合膜的物理性能和抗氧化特性，這對高脂和易氧化食品的貯藏保鮮及貨架期的延長有積極意義。