黃芩葉斑病病原菌鑒定和藥劑室內毒力測定

蔣晶晶 趙嬌嬌 陳愛昌 曹素芳 李繼平 李青青 徐美蓉 漆永紅,*

(1 甘肅省農業科學院植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070；2 甘肅農業大學園藝學院，甘肅 蘭州 730070；3 定西市植保植檢站，甘肅 定西 743000；4 甘肅省農業科學院林果花卉研究所，甘肅 蘭州 730070；5甘肅省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，甘肅 蘭州 730070)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)為唇形科(Labiatae)黃芩屬(Scutellaria)植物，是多年生草本植物。從藥用植物學角度，黃芩分為根、莖葉、種子和種殼四個部位，主要有效成分為黃酮類化合物，具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。黃芩廣泛分布于溫帶和熱帶山脈地區，遍及歐洲、北美和東亞[1]。在我國，黃芩主產于甘肅、陜西、山西等省[2]，其中甘肅省定西市作為道地黃芩主產區之一，生產的黃芩具有產量高、品質佳、功效好等優勢。近年來，由于市場需求量的增加，黃芩種植面積逐步擴大，生產上連年種植，導致黃芩病害出現明顯加重的趨勢。目前，國內外已報道的黃芩病害和其病原種類為：由鐮孢屬(Fusariumsp.)引起的根腐病[3]、北方根結線蟲(Meloidogynehapla)引起的根結線蟲病、齊整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)引起的葉枯病、白粉菌屬(Erysiphesp.)引起的白粉病[4]、立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn.)引起的莖基腐病和灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)引起的灰霉病[5]等，但引起黃芩葉斑病的病原菌相關研究仍鮮見報道。

鏈格孢屬(Alternariasp.)是一種極為常見的病原菌，具有適應強、寄主范圍廣、為害嚴重等特點[6]。全世界已描述的鏈格孢種有約500個，其中95%以上寄生在植物上，可引起萵筍[7]、櫻桃[8]、枸杞[9]、甜葉菊[10]和二月蘭[11]等多種作物葉斑病。甘肅省農業科學院植物保護研究所經濟作物病害研究室于2020年8月在甘肅省隴西縣對黃芩病害調查時發現，葉斑病的病田率達50%，病株率達20%～35%。田間大面積黃芩葉片上普遍出現不規則的黑褐色病斑，擴展至整個葉面，導致葉片發黃，枯萎；植株光合作用嚴重受阻，造成巨大的經濟損失，嚴重影響黃芩的產量和品質。因此，本試驗采用組織分離法對黃芩葉斑病的病原菌進行分離，柯赫氏法則進行致病性測定，結合形態學和分子生物學手段對病原菌進行鑒定，旨在明確該病害的病原菌種類，為科學診斷和研究病害發生規律提供科學依據；同時，室內測定了4種殺菌劑對病原菌的毒力，以期篩選出高效、低毒、低殘留的藥劑，為該病害的田間防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 于2020年8月在甘肅省隴西縣黃芩主產區福星鎮、首陽鎮、菜子鎮和文峰鎮進行樣品采集，每個地區隨機選取3～5塊田進行病葉調查和采集，共獲得38份病葉，及時帶回甘肅省農業科學院植物保護研究所經濟作物病害研究室進行病原菌分離。

1.1.2 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g；馬鈴薯胡蘿卜瓊脂(potato carrot agar，PCA)培養基：馬鈴薯20 g、胡蘿卜20 g；玉米粉(corn meal agar，CMA)培養基：玉米粉300 g、瓊脂14 g；蔗糖碳酸鈣(sucrose CaCO3agar，SA)培養基：蔗糖20 g、碳酸鈣30 g。以上培養基均加入瓊脂14 g、蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌備用。

1.1.3 供試材料 供試菌株：茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)。

供試藥劑：0.3%丁子香酚可溶液劑(保定市亞達益農農業科技有限公司)、0.4%蛇床子素可溶液劑(楊凌馥稷生物科技有限公司)、98.5%腐霉利(Procymidone)原藥(江西禾益化工有限公司)、97%咯菌腈(Fludioxonil)原藥(河北冠龍農化有限公司)。

1.2 病原菌分離和純化

采用常規組織分離法[12-13]進行病原菌分離。選擇具有典型葉斑病癥狀的葉片，剪病健交界處5 mm×5 mm的病組織，用1%次氯酸鈉消毒40 s，75%酒精消毒40 s，無菌水沖洗2次后置于滅菌濾紙上晾干。將病組織塊接種于PDA培養基上，每皿4塊，置25℃恒溫培養箱中黑暗培養4 d，待長出菌落后挑取菌落邊緣菌絲進行純化，并轉接至PDA斜面，4℃保存備用。

1.3 病原菌形態鑒定

1.3.1 純培養特征 用滅菌打孔器在菌落邊緣打出直徑5 mm的菌餅，接種在PDA培養基的中央，每個菌株重復3次，25℃黑暗條件下培養7 d后觀察記錄菌落形態和顏色等特征。

1.3.2 分生孢子形態觀察和鑒定 將菌餅分別接種至PDA、PCA、CMA和SA培養基中央，18℃恒溫黑暗培養10 d后觀察產孢情況。將產生的分生孢子用無菌水沖洗，在光學顯微鏡下對鏈格孢的分生孢子大小、顏色、產生的橫隔、縱隔數進行統計，參考張天宇[14]和Simmons等[15]對鏈格孢屬種的描述來鑒定病原菌的種類。

1.3.3 產孢表型觀察 將濾紙剪成比載玻片小的長方形，并在濾紙中間剪約1 cm×2 cm的孔，將其置于載玻片上，放入培養皿內濕熱滅菌后備用。從菌落邊緣取適量菌絲和孢子均勻涂抹在小孔一側，加適量無菌水將濾紙浸濕，后置于25℃生化培養箱，保濕并在12 h光照/12 h 黑暗交替下培養5～9 d后在光學顯微鏡下拍照。

1.4 病原菌基因組DNA提取及多基因分子生物學鑒定

將菌株接種在鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上進行培養，5 d后收集菌絲，采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)法[16]提取菌株基因組DNA。將提取的DNA用核糖體轉錄間隔區序列(ITS)[17]、過敏原基因(Alta1)[18]、質膜腺苷三磷酸基因(ATPase)[19]、組蛋白基因(His3)進行PCR擴增，引物(表1)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

PCR擴增反應程序：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，72℃延伸45 s，72℃補充延伸5 min，退火溫度ITS、Alta1、ATPase、His3分別為54、57、59、66℃，反應30 s，共30個循環；PCR反應體系25 μL：2×PCR Master Mix 12.5 μL，DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。

制備1.2%瓊脂糖凝膠，120 V電泳30 min，0.5 mg·L-1EB溶液中染色10 min，置于Gel.Doc 2000型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)進行拍照保存。將具特異性條帶PCR產物送上海生工生物工程有限公司測序，所測序列與NCBI的GenBank數據庫中已知核酸序列進行相似性比較。采用DNAMAN 7軟件對核苷酸序列進行多重比對，對序列進行剪切拼接。使用遺傳進化軟件MEGA 5.2，以鄰接法(neighbor-joining, NJ)，構建系統發育樹，采用自展法(bootstrap method)進行檢驗，重復1 000次。

1.5 致病性測定

分別采用離體葉片菌餅接種法和孢子懸浮液活體噴霧接種法進行致病性測定。菌餅的制備：將試管斜面保存的菌種接種于PDA平板上，25℃恒溫黑暗培養4 d后，用5 mm的打孔器在菌落邊緣打孔待用；孢子懸浮液的制備：將供試菌株接種在PCA平板上，18℃ 12 h光照/12 h黑暗培養11 d后，用滅菌水沖洗分生孢子，用血球計數器配置成濃度為1×105個·mL-1孢子懸浮液待用。

1.5.1 菌餅有傷(針刺)和無傷接種法 選擇健康的黃芩葉片，先用75%酒精表面擦拭消毒，再用無菌水清洗2次，置于鋪有保濕紗布的盤內待用。將供試菌株用打孔器切取直徑為5 mm的菌餅，菌絲面朝下、貼于已消毒處理的黃芩葉片正面，每個葉片接種2個菌餅，重復3次，同時接種空白PDA培養基作為對照。置于25℃恒溫培養箱內，黑暗培養，每天觀察并記錄發病情況。

1.5.2 孢子懸浮液噴霧接種法 使用小噴壺將添加0.5%吐溫-20的孢子懸浮液均勻噴霧接種到健康的盆栽黃芩葉片上，只噴霧0.5%吐溫-20的處理作為對照，之后正常溫室管理，每天觀察發病癥狀并照相。待接種后的黃芩葉片發病，將病原菌再次分離純化，觀察分離物與接種菌是否相同。

1.6 藥劑室內毒力測定

采用菌絲生長速率法進行測定[20]。將供試菌株活化培養5 d后，在接近菌落邊緣生長一致的地方打取直徑為5 mm的菌餅，分別接入含不同濃度殺菌劑的PDA培養基平板中央，每種殺菌劑均設5個不同的濃度梯度(表2)，以不含藥PDA培養基為空白對照，每處理3次重復，置于26℃恒溫培養箱培養觀察，第8天采用十字交叉法量取菌落直徑，計算不同藥劑下菌絲生長抑制率，根據殺菌劑濃度的對數值(x)和抑菌生長率的幾率值(y)建立回歸方程y=ax+b，采用SPSS17.0數據處理軟件計算得到相關系數(R)和致死中濃度(EC50)。根據EC50分析比較不同殺菌劑對供試病原菌的毒力。

表2 4種殺菌劑的濃度

2 結果與分析

2.1 黃芩葉斑病田間發病癥狀

田間調查發現，黃芩葉斑病始發于7月初，8月中下旬為害最嚴重。該病害的典型癥狀為：發病初期，葉片出現不規則的黑褐色小病斑(圖1-A)，隨著病情發展，病斑逐漸擴大且相互連接，迅速自下而上蔓延，導致葉片發黃(圖1-B)，嚴重時枯萎，甚至脫落。

注：A: 發病初期；B: 發病后期；C：健康葉片。

2.2 病原菌的致病性測定

致病性測定結果表明，分離菌株經過柯赫氏法則驗證，表明該菌對黃芩葉片均有致病性，其中代表性菌株HQ23-5和HQ13-5離體葉片接種第3天開始發病，有傷和無傷接種均可發病(圖2-A～D)，發病率均達100%，兩種菌株致病力差異較小，而對照有傷和無傷接種均沒有發病(圖2-E、F)。孢子懸浮液接種6 d后葉片上出現零星病斑，發病初期病斑呈黑褐色小斑點(圖3-A)，后逐漸擴大為不規則融合斑(圖3-B)，甚至出現幼芽枯死(圖3-C)，而對照葉片未發病(圖3-D)。將上述發病葉片進行病原菌再分離、純化培養，得到與原接種菌相同的病原菌，分離率為100%，表明HQ23-5和HQ13-5均為黃芩葉斑病的致病菌。

注：A：菌株HQ23-5有傷接種；B：菌株HQ23-5無傷接種；C：菌株HQ13-5有傷接種；D：菌株HQ13-5無傷接種；E：有傷接種CK；F：無傷接種CK。

注：A、B：葉片病斑變黑；C：芽枯死；D：對照。

2.3 形態學鑒定結果

對采集的38份病葉進行分離培養、單孢純化后，共獲得20株分離物(表3)，分別編號為福星鎮HQ6-(5株)，首陽鎮HQ9-(2株)，菜子鎮HQ13-(7株)，文峰鎮HQ23-(6株)。根據培養基基質色、菌落正反面顏色、PDA培養基是否產孢和喙的形態以及菌株rDNA-ITS序列比對依據序列相似度大于99%的菌株為同一個種的原則進行歸類[21]，將獲得的20株菌株分為兩大類，在每一類中隨機選取代表性病原菌HQ23-5和HQ13-5進行研究。

表3 20株病原菌分離物的特征

菌株HQ23-5在PDA平板上培養初期時菌絲為白色，呈放射狀生長，后逐漸變為灰褐色或墨綠色絨狀，邊緣整齊，背面深橄欖綠或黑色，菌絲粗壯，6 d后菌落直徑達8.5 cm(圖4-A、B)。分生孢子梗淺褐色，多數單生于菌絲側面，偶有分支，直立或略彎曲，有分隔。分生孢子淺褐色或褐色，橢圓形、卵形、棍棒狀，少數倒梨形，有1～7個橫隔膜，0～5個豎或斜隔膜，分隔處有明顯縊縮現象，成熟的孢子有1～4個較粗而色深的主橫隔膜，呈黑褐色。分生孢子大小(24.3～58.5)μm×(3.4～5.3)μm，呈鏈狀生長，不分支或少分支，每條鏈上有6～10個孢子。喙或假喙柱狀或錐狀，淺褐色，有隔膜，基部略微膨大，大小為(3.3～3.4)μm×(3.4～4.9)μm(圖4-C、D)。綜合以上結果，根據形態學特征可初步鑒定為細極鏈格孢(A.tenuissima)。

菌株HQ13-5在PDA平板上培養初期時菌落為灰白色，后逐漸變為灰色，氣生菌絲發達(圖4-E、F)，培養基基質變黃褐色。此菌在PDA和CMA培養基上不產孢。PCA和SA上易產孢，11 d即可產生大量分生孢子。分生孢子常單生，倒棍棒形，青暗褐色，具7～13個橫隔膜及1～7個縱、斜隔膜，橫隔膜處縊縮，孢身大小為(60～136)μm×(16.5～28)μm。分生孢子頂端有細長的喙，喙絲狀，淺褐色，分枝或不分枝。分生孢子梗褐色，直或彎曲，具隔膜(圖4-G、H)。綜合以上結果，根據形態學特征可初步鑒定為茄鏈格孢(A.solani)。

注：A～D為菌株HQ23-5。A：菌落正面；B：菌落背面；C：分生孢子形態；D：產孢表型。E～H為菌株HQ13-5。E：菌落正面；F：菌落背面；G：分生孢子；H：產孢表型。

2.4 病原菌分子生物學鑒定及親緣關系分析

提取菌株HQ13-5和HQ23-5的基因組DNA后，使用引物ITS基因序列進行PCR擴增，條帶清晰，無拖尾雜帶現象，分別獲得518和515 bp的片段，序列提交GenBank數據庫，分別獲得登錄號MZ305073和MZ305076。經Nucleotide BLAST分析發現，菌株與A.tomatophila、A.alternata、A.solani和A.tenuissima的同源性相近，無法將其區分開。因此選用過敏原基因(Alta1)和質膜腺苷三磷酸基因(ATPase)的特異性引物進行PCR擴增，Alta1引物分別獲得大小為444和450 bp的片段(菌株HQ13-5的Alta1登錄號為MZ305071，菌株HQ23-5的Alta1登錄號為MZ305074)，ATPase引物分別獲得大小為1 205和1 198 bp的片段(菌株HQ13-5的ATPase登錄號為MZ305072，菌株HQ23-5的ATPase登錄號為MZ305075)。

利用ITS、Alta1、ATPase的基因序列結合鏈格孢菌屬的模式菌株參考序列，以鄰接法構建多基因系統發育樹，結果表明，菌株HQ23-5與A.alternate(鏈格孢)和A.tenuissima(細極鏈格孢)同聚為一個大分枝，菌株HQ13-5與A.solani(茄鏈格孢)聚為一支(圖5)。基于多基因鑒定結果，對菌株進一步進行組蛋白基因(His3)基因的PCR擴增、測序。結果表明，菌株HQ23-5獲得大小為550 bp的片段，而菌株HQ13-5獲得大小為489 bp的片段，構建系統發育樹可以準確的將細極鏈格孢(A.tenuissima)、鏈格孢(A.alternata)和茄鏈格孢(A.solani)區分(圖6)。綜合以上結果，結合形態學與分子生物學特征，甘肅省定西市隴西縣黃芩葉斑病的病原菌鑒定為茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)，其中福星鎮的5個菌株均為細極鏈格孢(A.tenuissima)，菜子鎮的7個菌株均為茄鏈格孢(A.solani)，而首陽鎮和文峰鎮茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)均有分布。

圖5 基于rDNA-ITS, Alt a1和ATPase基因序列構建的系統發育樹

圖6 基于His 3基因序列構建的系統發育樹

2.5 不同培養基對茄鏈格孢(A. solani)和細極鏈格孢(A. tenuissima)產孢的影響

由表4可知，PDA、CMA、PCA和SA四種培養基均可以促進細極鏈格孢(A.tenuissima)產孢，四者差異顯著；四種培養基對茄鏈格孢(A.solani)的產孢量有明顯影響，其中PDA、CMA分別與PCA和SA差異顯著，而PDA與CMA之間差異不顯著。茄鏈格孢(A.solani)只在PCA和SA培養基上產孢且在SA培養基上產孢量最大。培養11 d觀察到菌株HQ13-5上有產孢結構且產孢量為4.2×104個·mL-1，說明SA培養基可促進茄鏈格孢(A.solani)產孢。

表4 不同培養基對菌株產孢量的影響

2.6 殺菌劑對茄鏈格孢(A. solani)和細極鏈格孢(A. tenuissima)菌絲生長的影響

4種殺菌劑對茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)菌絲生長均有抑制作用(表5)，各藥劑對菌絲的抑制率隨著處理濃度的增大而增加，其中97%咯菌腈對茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)的菌絲抑制作用最強，EC50分別為0.06和0.04 mg·L-1，其次為0.3%丁子香酚可溶液劑和0.4%蛇床子素可溶液劑，而98.5%腐霉利的抑制作用最差，EC50分別為5.03和4.82 mg·L-1。從毒力回歸方程b值來看，97%咯菌腈對茄鏈格孢(A.solani)、0.3%丁子香酚可溶液劑對細極鏈格孢(A.tenuissima)的b值均大于其他藥劑，表明茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)對97%咯菌腈和0.3%丁子香酚可溶液劑的敏感性比其他藥劑高。綜合EC50和b值篩選出對茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)菌絲有較強抑制作用的藥劑為97%咯菌腈。

表5 4種殺菌劑對茄鏈格孢和細極鏈格孢菌絲生長的抑制效果

3 討論

葉斑病是近年來黃芩主要葉部病害之一，發生較為普遍，導致黃芩產量降低，品質受到影響。本試驗調查發現，該病害田間主要為害葉片，表面呈不規則的黑褐色病斑，嚴重時全部葉片枯死、脫落。

鏈格孢屬真菌引起的病害在經濟作物、糧食作物和果蔬生產中均有發生，嚴重阻礙了我國農業生產的發展[22]。鏈格孢屬真菌具有明顯的孢子形態特征，較其他真菌易于區分和鑒別，但由于寄主、培養條件，特別是營養條件、pH值、溫度、光照等諸多因素的不一致，使孢子的形態和菌落形態變化較大，因此鏈格孢屬下種的準確描述和鑒定非常困難。近年來隨著分子生物學技術的不斷發展，核苷酸序列分析和系統發育關系在鏈格孢分類中被廣泛應用，多個核苷酸序列或基因片段被引入鏈格孢的系統發育分析，如ITS、mtLSU、endoPG、TUB[23]、mtSSU、ATPase、ACT、CHS、EF-1a、Alta1、gpd、CAL[24]、OPA2-1[25]、IGS[26]、His3[27]等。本試驗通過形態學、致病性測定、柯赫氏法則驗證，同時結合ITS、Alta1、ATPase和His3這4個基因序列對鏈格孢菌株的系統發育進行了研究，首次明確了甘肅省隴西縣不同地區黃芩葉斑病的病原菌為茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)。

據報道，鏈格孢屬真菌在國內外引起多種植物病害[28]，如馬鈴薯早疫病[29]和葉斑病[30]、紅棗黑斑病[31]、藍莓葉斑病[32]等。Moreno等[33]報道，鏈格孢屬真菌不僅通過菌絲和孢子侵入寄主，還能在寄主植物上分泌毒素，人畜食用后會對健康造成危害，甚至會引起癌變，因此，關于由茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)引起的黃芩葉斑病應受到更大的關注。

毒力回歸方程能有效反映不同濃度殺菌劑與抑菌效果的關系，EC50是衡量殺菌劑毒力強弱的標準[34]。目前14α-脫甲基抑制劑類(14α-demethylation inhibitors, DMIs)殺菌劑(如咪鮮胺、苯醚甲環唑)大量應用于細極鏈格孢(A.tenuissima)引起的植物病害防治，雖效果較好，但基于藥材對農藥要求的特殊性，其造成的農殘超標和環境污染不容忽視。本試驗在室內篩選出咯菌腈對黃芩葉斑病的兩種病原菌茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)的菌絲抑制作用最強，EC50最低，其次為丁子香酚、蛇床子素，而腐霉利的抑制作用最差。據報道，丁子香酚作為一種新型植物源殺菌劑，對鏈格孢菌(A.alternata)[35]具有很好的防治效果，咯菌腈和腐霉利對蕓薹鏈格孢(A.braassiciola)的抑菌效果最好[36]，這可能與病原菌對藥劑的敏感性不同有關。本試驗僅在室內測定了不同殺菌劑對茄鏈格孢和細極鏈格孢的毒力，關于咯菌腈對黃芩葉斑病的田間防治效果仍有待于進一步試驗驗證。

4 結論

黃芩葉斑病發生普遍，主要為害葉片，通過形態學和ITS、Alta1、ATPase、His3等4個基因序列首次明確了甘肅省不同地區黃芩葉斑病的病原菌為茄鏈格孢(A.solani)和細極鏈格孢(A.tenuissima)，室內篩選出咯菌腈的抑菌效果較好。