蘋果短鏈脫氫酶基因MdSDR響應腐爛病菌侵染的功能研究

王帥樂 肖珂雨 王維東 黃麗麗

(西北農林科技大學旱區作物逆境生物學國家重點實驗室/植物保護學院, 陜西 楊凌 712100)

短鏈脫氫/還原酶(short-chain dehydrogenases/reductase, SDR)是一類NAD(P)(H)依賴的氧化還原酶，負責催化生物體內的氧化還原反應[1-3]。SDR在高等植物中分布廣泛[4]，主要參與生物堿、萜類、酚類物質和激素等多種次級代謝途徑，增強了植物對細菌、真菌、病毒、動物和昆蟲等生物脅迫以及非生物脅迫的適應能力，并且在植物傳粉、種子傳播和種間競爭中發揮重要作用[1,5-8]。同時，SDR也參與多種初級代謝，維持植物正常的生長發育。例如，在葉綠素的合成途徑中，SDR家族的原葉綠體氧化還原酶(protochloropyllide oxidoreductase, POR)能將原葉綠素轉化為葉綠素[9-10]；在脂肪酸合成途徑中，SDR家族的β-酮脂酰-ACP還原酶(β-ketoacyl-ACP reductase, KAR)和烯脂酰-ACP還原酶(enoyl-ACP reductase, ENR)能催化還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)依賴的兩個還原步驟，是植物脂肪酸生物合成的兩種關鍵酶[11-12]。

脂肪酸是細胞膜、栓質和角質蠟的關鍵成分，為植物抵御環境脅迫提供了物理屏障[13-14]。植物能通過改變不飽和脂肪酸的含量來調節膜的流動性，從而維持適合關鍵整合蛋白(integral protein)發揮功能的環境[15-16]。例如，在高溫脅迫環境下，野生型煙草葉綠體中的光合蛋白出現熱變性和光合效率下降。而三元脂肪酸(trienoic fatty acids，TAs)表達被抑制的轉基因植株中，未檢測到光合蛋白熱變性，其光合效率降幅較小[17]。另外，脂肪酸也參與病原脅迫響應。研究發現，游離亞麻酸既是一種脅迫信號分子，也是植物氧化脂質(如茉莉酸)生物合成的前體[18-19]。許多研究也證明，葉綠體油酸(oleic acid, OA)和壬二酸(azelaic acid, AZA)水平對擬南芥的生物脅迫響應至關重要，可以引發細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)和激發系統獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)[20-21]。另外，植物葉片中脂肪酸的積累能刺激植物脂滴(lipid droplets，LDs)的產生。而脂滴在植物脅迫應答、激素信號途徑和植物生長發育中起重要作用[22-23]。例如，脂滴表面的油體鈣蛋白caleosin和油體固醇蛋白steroleosin等蛋白具有酶活性，其中caleosin具有過氧化酶活性，可以將α-亞麻酸衍生物轉化為各種氧化脂類植保素；steroleosin是一種甾醇脫氫酶，可以將甾醇底物轉化為油菜素類固醇(brassinosteroids，BRs)，從而調控生長發育和脅迫響應[24-25]。上述研究結果均表明，脂肪酸在植物抵抗生物脅迫中發揮著重要的作用。

在蘋果(Malusdomestica)中，目前關于SDR基因功能的研究仍鮮有報道。西北農林科技大學果樹病害病原生物學及綜合防治團隊前期以富士蘋果cDNA為模板克隆獲得MdSDR基因編碼區(coding sequence，CDS)全長序列，并通過預測發現其可能與脂肪酸的合成有關[26]。為了驗證MdSDR蛋白是否參與脂肪酸的合成和調控植物免疫，本研究通過農桿菌介導的瞬時表達技術及實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術探究蘋果MdSDR對脂肪酸合成中關鍵基因表達的影響，揭示MdSDR在脂肪酸合成中的重要作用，并利用蘋果瞬時表達技術探究MdSDR對蘋果樹腐爛病菌侵染的影響，初步研究其抗逆功能和作用機理，旨在為蘋果抗性品種的研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

嘎啦蘋果組培苗(Malusdomesticcv.Royal gala)由西北農林科技大學園藝學院李明軍教授實驗室惠贈。組織培養植株生長于MS培養基中，培養基配方為：4.43 g·L-1MS+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂+0.3 mg·L-16-芐氨基嘌呤+0.2 mg·L-1吲哚-3-乙酸，pH值為5.8；組培苗置于人工智能氣候箱(RXZ-500-D-PED，寧波江南儀器廠)內培養，培養條件為：溫度 25℃，光照16 h/黑暗8 h，光照度6 400 Lx，相對濕度60%。每15 d更換一次培養基。

1.2 菌株和質粒載體

大腸桿菌DH5α、農桿菌GV3101及載體pCAMBIA1302均購自北京擎科新業生物技術有限公司；蘋果腐爛病菌03-8(Valsamali)保存于西北農林科技大學。

1.3 植物表達載體的構建

以富士蘋果mRNA反轉錄合成的cDNA為模板，利用特異性引物MdSDR-F、MdSDR-R對MdSDR基因進行PCR擴增，采用快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒II(DP1722，Bioteke，北京)對目的基因條帶進行回收。將回收產物與線性化載體pCAMBIA1302連接構建重組質粒pCAMBIA1302-MdSDR。熱激法轉化大腸桿菌DH5α，進行卡那霉素抗性篩選及菌落PCR驗證后提取質粒送至上海生工生物工程股份有限公司測序。將測序重組質粒及空載體(對照)分別電擊轉化至農桿菌GV3101，卡那霉素抗性篩選及菌落PCR驗證后于-80℃冰箱保存備用。

1.4 農桿菌介導的蘋果組培苗瞬時轉化

用含50 μg·mL-1卡那霉素及50 μg·mL-1利福平的YEP培養基，以28℃、200 r·min-1的條件培養含有pCAMBIA1302-MdSDR和pCAMBIA1302表達載體的農桿菌16 h，6 000 r·min-1離心10 min收集菌體，用0.01 mol·L-1的MgCl2溶液清洗2次，最終用含100 μmol·L-1乙酰丁香酮及10 μmol·L-12-嗎啉乙磺酸(4-morpholineethanesulfonic acid，MES)的MgCl2溶液重懸菌體，使其OD600值為1。挑選健康、長勢相近的4周齡組培苗若干，使用真空滲透的方法[26]對其進行瞬時轉化，轉化后的組培苗培養條件與1.1中的組培條件相同。

1.5 蘋果總RNA提取及cDNA的合成

組培苗瞬時表達48 h后隨機選取葉片樣品進行蘋果總RNA的提取，提取方法參照快速通用植物RNA提取試劑盒說明書(0416-50gk，北京華越洋生物有限公司)，提取完成后對其濃度進行測定，于-80℃冰箱保存備用。cDNA的合成參照High Capacity cDNA反轉錄試劑盒說明書(4368813，Thermo Fisher scientific，美國)進行，反轉錄產物于-80℃冰箱保存備用。

1.6 實時熒光定量PCR分析

在NCBI數據庫中找到MdβCT、MdACCase、MdKAR、MdKASⅠ、MdKASⅡ、MdHAD、MdENR等與蘋果脂肪酸合成相關的基因序列以及與植物脂滴調控相關基因MdSEIPIN[27-28]，并以MdEF-1α為內參基因[29]。使用Primier 5軟件對上述基因進行引物設計(表1)。

表1 引物序列

利用PCR技術檢測上述引物的特異性，PCR反應體系為20 μL：10 μL 2×Taq MasterMix、上下游引物各0.5 μL、1 μL cDNA、8 μL ddH2O。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環。

基因相對表達水平測定：按照2×SYBR?Green PCR Master Mix(A311-10，北京康潤誠業生物科技有限公司)說明書配制qRT-PCR反應體系，每個樣品設3個重復。qRT-PCR反應體系為20 μL：10 μL 2×RealStar Green Power Mixture、10 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL、1.5 μL cDNA、7.5 μL ddH2O。使用羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR儀，反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個循環；熔解反應程序為：95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s。

1.7 真菌活化與侵染試驗

將蘋果腐爛病菌(V.mali)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養基上活化，于25℃條件下培養3 d。組培苗瞬時轉化48 h后取葉片刺傷接種V.mali。將葉柄插入水瓊脂中保濕，25℃共培養36 h左右，拍照并用Image J軟件計算病斑直徑，重復3次。使用GraphPad Prism 9作圖并用SPSS 26.0進行t測驗分析。為了減少試驗誤差，每次重復使用至少30個葉片，取自長勢相似的組培苗。

1.8 蘋果葉片脂肪酸含量的測定

組培苗瞬時表達48 h后取葉片樣品，液氮速凍后用干冰保存運輸，送至西安邁維代謝生物科技有限公司進行脂肪酸含量及種類的測定。處理組與對照組各做3次重復，使用GraphPad Prism 9作圖并用SPSS 26.0進行t測驗分析。

1.9 蘋果葉片中脂滴的染色觀察

尼羅紅(HY-D0718，MedChemExpress, 美國)在緩沖液中稀釋至200 mmol·L-1，pH值為7。將組培苗瞬時表達48 h后取葉片樣品，在尼羅紅染液中37℃避光孵育5～10 min，洗去染色液后制片。用FV3000激光共聚焦掃描顯微鏡(奧林巴斯，日本)觀察，由488 nm激發，在500～540 nm光譜下收集信號。

2 結果與分析

2.1 蘋果葉片抗病性檢測

為了探究MdSDR蛋白在植物抗生物脅迫中的作用，在蘋果組培苗葉片中瞬時表達MdSDR基因后接種V.mali，檢測病斑變化情況。結果顯示，過表達MdSDR的蘋果葉片的病斑明顯小于對照(圖1-A)。平均病斑直徑統計結果顯示，過表達MdSDR的蘋果葉片的病斑直徑顯著小于(P<0.001)對照(約14.46%)(圖1-B)，表明過表達MdSDR提高了蘋果葉片對V.mali的抗病性。

注：A：V. mail.侵染蘋果葉片36 h后的葉片表型；B：V. mail.侵染蘋果葉片36 h后的平均病斑直徑。***表示在P<0.001水平差異顯著。

2.2 脂肪酸合成相關關鍵基因的表達水平檢測

為了探究MdSDR對植物脂肪酸合成的影響，對脂肪酸合成通路關鍵酶編碼基因的表達水平進行了檢測。與對照相比，瞬時過表達MdSDR蘋果葉片中脂肪酸從頭合成通路中的相關基因全部顯著上調表達，其中MdACCase、MdKAR和MdENR上調幅度較大，MdACCase上調48.41倍，MdKAR上調129.79倍，MdENR上調168.20倍。MdβCT、MdKASⅠ、MdKASⅡ和MdHAD均呈現出上調表達的趨勢，其中MdβCT、MdKASⅠ和MdKASⅡ均上調約5倍，MdHAD上調8.67倍(圖2)。上述結果表明，MdSDR蛋白參與調控脂肪酸的生物合成。

注：***表示在P<0.001水平差異顯著；****表示在P<0.000 1水平差異顯著。

2.3 蘋果葉片脂肪酸含量測定

為了探究過表達MdSDR對植物葉片中脂肪酸積累水平的影響，對蘋果葉片中的脂肪酸含量進行了測定。通過對試驗組與對照組數據進行差異顯著性分析，發現過表達MdSDR的蘋果葉片中各種脂肪酸含量未發生顯著變化(P>0.05)(圖3)。

圖3 脂肪酸相對含量

2.4 脂滴合成關鍵基因的表達水平檢測

為了驗證上述推測，過表達MdSDR后檢測了調控脂滴形成的關鍵基因MdSEIPIN的表達水平變化。結果顯示，瞬時表達MdSDR后，蘋果葉片中MdSEIPIN基因的表達水平顯著提高(圖4-A)(P<0.05)，表明瞬時表達MdSDR促進了脂滴的生物合成。Western Blot結果顯示，在瞬時表達MdSDR基因的蘋果組培苗葉片中檢測到MdSDR蛋白(圖4-B)，表明通過農桿菌介導瞬時表達技術，MdSDR蛋白在蘋果組培苗葉片中成功表達。

注：A：MdSEIPIN相對表達水平；B：MdSDR蛋白表達檢測。*表示在P<0.05水平差異顯著。

2.5 蘋果葉片中脂滴的染色觀察

本研究采用尼羅紅染色[30]觀察瞬時表達MdSDR的蘋果葉片樣品，結果顯示，瞬時表達MdSDR后的蘋果葉片出現大量的點狀綠色熒光(圖5-A)，而在對照中并未發現有大量的點狀綠色熒光(圖5-B)。本試驗過表達的MdSDR蛋白上融合有GFP標簽，因此為了排除GFP熒光給試驗帶來的干擾，單獨表達了MdSDR-GFP和GFP，觀察并未發現點狀綠色熒光(圖5-C、D)。綜上所述，瞬時表達MdSDR促進了脂滴的形成。

注：脂滴被尼羅紅染色后激發出的熒光呈點分布。A：瞬時表達MdSDR-GFP后用尼羅紅染色的蘋果葉片；B：瞬時表達GFP后用尼羅紅染色的蘋果葉片；C：瞬時表達MdSDR-GFP后未染色的蘋 果葉片；D：瞬時表達GFP后未染色的蘋果葉片。

3 討論

短鏈脫氫/還原酶不僅可以參與調控植物初級代謝，如脂肪酸生物合成、葉綠素生物合成或降解，還可以參與調控植物的次級代謝，如萜類、類固醇、酚類和生物堿的生物合成[31]。在脂肪酸生物合成的過程中，乙酰CoA的羧化反應是脂肪酸合成通路的限速步驟，故乙酰CoA羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACCase)活性控制著脂肪酸的合成速度；在脂肪酸鏈延伸階段中，β-酮脂酰-ACP合酶(β-ketoacyl-ACP synthaseⅡ, KAS)能催化第一步的縮合反應；同時，β-酮脂酰-ACP還原酶(β-ketoacyl-ACP reductase, KAR)和烯脂酰-ACP還原酶(enoyl-ACP reductase, ENR)負責催化其中兩步還原反應，即在還原型輔酶II NADPH的協助下，KAR催化β-酮丁酰基的β-位羰基還原為羥基，ENR催化△2-烯丁酰基的α-雙鍵還原為單鍵；而β-羥脂酰-ACP脫水酶(β-hydrdoxyacyl-ACP dehydrase, HAD)則負責催化β-羥丁酰基α、β-碳原子間的脫水反應[32]。本研究發現瞬時過表達MdSDR后，蘋果中乙酰CoA羧化酶(MdACCase)基因、β-酮脂酰-ACP合酶(MdKAS)基因、β-酮脂酰-ACP還原酶(MdKAR)基因、烯脂酰-ACP還原酶(MdENR)基因的表達水平顯著上調(圖2)。上述結果表明，MdSDR能參與調控植物脂肪酸的生物合成過程，這與本實驗室前期預測的結果[26]一致。

已有研究表明脂肪酸能參與調控植物的免疫反應[1,21]。例如茄子中棕櫚油酸的積累提高了植物對白粉病菌的抗病性[33]；番茄中棕櫚油酸的積累增加了植物對黃萎病菌的抗病性[34]；亞油酸和亞麻酸的積累會顯著提升鱷梨對炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)和番茄對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗病性[35-36]；根際微生物誘導植物對灰霉病菌(Botrytiscinerea)的抗病性同樣與植物中亞油酸和亞麻酸積累水平密切相關[37]。本研究發現，過表達MdSDR能夠提高蘋果對腐爛病菌的抗性(圖1)，然而蘋果葉片中脂肪酸含量無顯著變化(圖3)(P>0.05)。因此推測MdSDR參與調控脂肪酸的生物合成，但并未通過增加脂肪酸含量來提高蘋果抗性。

脂肪酸作為初級代謝產物，是生物體內多種中性脂質生物合成的前體。然而過高水平的脂肪酸會對細胞造成損傷[38]。因此生物體會通過多種途徑將脂肪酸轉化成中性脂質，例如脂肪酸能夠通過多步反應，最終在SEIPIN蛋白調控下形成了成熟的脂滴[28,30]，保持了細胞內的脂肪酸水平的穩態[22,39]。

脂滴是由富含膜蛋白的單層磷脂分子層包裹中性脂類物質組成的細胞器[40]。脂滴一般存在于種子等植物的營養儲存器官中，為植物提供能量和參與植物生長發育調控。葉片等光合組織中脂滴的數量通常遠小于種子和花，但葉片脂滴能參與調控植物的非生物和生物脅迫響應[23,39]。例如，脂滴相關蛋白(LD-associated protein，LDAP)能調控植物脂滴的產生。對擬南芥ldap1/ldap3雙敲除突變體的研究發現，突變體植物比野生型更容易受到干旱脅迫的影響[41]。而過表達ldap基因的擬南芥顯著提高了對干旱脅迫的抗性，這說明脂滴參與調控植物的干旱脅迫響應；另外兩種脂滴表面的雙加氧酶(dioxygenase)和caleosin能將α-亞麻酸轉化為氧化脂類(oxylipin)植保素，從而作為一種信號分子觸發植物的超敏反應(hypersensitive response, HR)[21，25]。這些研究均表明脂滴參與植物的非生物和生物脅迫響應。本研究發現過表達MdSDR促進了脂滴的產生(圖4、5)，同時也提高了蘋果對病原菌的抗性(圖1)。因此推測MdSDR蛋白通過調控脂肪酸的生物合成間接提高了脂滴的積累水平，從而提高了蘋果對腐爛病菌的抗性，但脂滴提高蘋果抗病性的具體調控機制還有待進一步研究。

4 結論

本研究利用農桿菌介導的瞬時轉化體系在蘋果組培苗中過表達MdSDR，檢測到蘋果葉片中脂滴數量增加，并且對V.mali的抗性顯著提高。初步證明MdSDR可以通過促進脂肪酸的生物合成，間接提高葉片脂滴的水平，從而增加植物的抗病性。該研究為理解植物抵抗病原脅迫的途徑提供了新思路。