杉木應壓木形成中的顯微特征及主要代謝成分變化

杜明秋 鐘珊麗 林二培 黃華宏

(浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300)

木材即次生木質部，是一種被廣泛使用的天然材料，與人類的經濟社會生活密切相關。樹木管胞細胞壁的發育是針葉樹木材形成的關鍵，次生壁作為管胞細胞壁中最厚的一層，對木材的材性影響較大。次生壁是由木質素(18%～35%)和碳水化合物(65%～75%)及少量其他物質交織而成的天然高分子材料，其中碳水化合物包括纖維素(40%～50%)與半纖維素(15%～35%)[1-3]。纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，其合成與葡萄糖聚合有關[4-5]。半纖維素因物種和細胞類型而異，主要分為三類，即聚木糖類、聚葡萄甘露糖類和聚半乳糖葡萄甘露糖類。針葉材的半纖維素以聚半乳糖葡萄甘露糖類為主[6]。與纖維素、半纖維素(本質上是多糖)不同，木質素是由3種醇單體(對香豆醇、松柏醇、芥子醇)通過碳-碳鍵和醚鍵連接形成的一種復雜酚類聚合物。這3種醇單體分別對應三類木質素單體，即對羥苯基木質素(para-hydroxy-phenyl lignin，H-木質素)、紫丁香基木質素(syringyl lignin，S-木質素)和愈創木基木質素(guaiacyl lignin，G-木質素)。其中，愈創木基木質素(G-木質素)是裸子植物中主要的木質素單體，這種芳香族聚合物是重要的次生壁成分[7]。纖維素、半纖維素和木質素等主要成分在次生壁中的類型、結構及含量是決定木材力學和化學特性的主要因素。

應力木通常指在外力作用下形成的彎曲樹干，或樹枝試圖恢復到自然生長狀態，而形成具特殊結構和化學組成的木材組織，是研究木材形成的良好模型[8]。在裸子植物中，常出現在傾斜樹干或樹枝的下部，被稱為應壓木，與之相對的部位稱為對應木[9-10]。在成熟的應壓木木質部中，管胞呈圓形或橢圓形，管胞間隙明顯，細胞壁出現螺紋裂隙；且應壓木次生壁中只有S1和S2層，缺失S3層，同時S2外圍多了一層高度木質化區域，稱為S2L[6,10-11]。S2L層的木質素含量高，并且異常出現(1,4)-β-半乳聚糖，是裸子植物應壓木的典型特征[6]。除了解剖特征的差異，前人通過對比杉木、火炬松與紅松應壓木和對應木極性代謝物圖譜，發現參與纖維素與木質素合成的代謝產物在應壓木中產生了顯著變化[12]。但在應壓木形成過程中，參與管胞壁主要成分合成的代謝物組分及其動態變化規律仍不明確。

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國最重要的針葉用材樹種之一，廣泛分布于秦嶺、淮河以南的16個省區，因生長速度快、樹干通直、材質均勻等優良特性而具有較高的經濟價值，是構成我國喬木林面積的優勢樹種之一。杉木與櫟樹、楊樹等10個樹種的人工林面積占我國喬木林面積的46.30%，是中國南方木材加工業原材料的主要來源[13]。開展杉木木材形成及其調控機制研究是杉木良種培育的重要內容，對提高杉木人工林效益有重要意義。因此，本研究利用應壓木模型，以不同處理時間的杉木應壓木為材料，對其管胞次生細胞壁結構、木質部主要組分及其代謝成分進行比較分析，以期揭示杉木應壓木形成過程中主要代謝物的動態變化規律，為杉木木材形成及其調控機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料與樣品制備

本研究采用的材料為杉木無性系洋061的3年生植株，于2018年5月將植株斜放，使之與豎直方向成45°夾角誘導應壓木形成。設置30、60和90 d 3個傾斜處理時間，處理結束后取樣，所有樣本均取自植株的相同高度與部位，其中斜放樹干下側為應壓木(compression wood, CW)、斜放樹干上側為對應木(opposite wood, OW)，同時取直立生長植株相同部位(直立木,control/straight wood)作為對照(CK)。將取樣部位剪下后，快速剝掉皮層并去掉髓心，將余下的木質部組織快速放入預冷的無菌離心管，液氮速凍后轉移至-80℃冰箱保存，用于成分的測定。每種木材樣本均取3個生物學重復，共6株無性系參試苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 顯微結構觀測 取不同處理時期的莖段，浸沒于2.5%戊二醛4℃固定軟化過夜，用樹脂包埋后利用RM2235切片機(徠卡微系統有限公司，德國)制成2 μm的切片，將切片用1%番紅染色，經酒精梯度脫水后，用中性樹膠封片后置于DM4000 M顯微鏡(徠卡微系統有限公司，德國)進行觀測和拍照。使用ImageJ測量每張圖像上的管胞壁厚，每個時期每個處理測50個樣本。參照王杰等[14]、林金安等[15]的報道，利用多糖單克隆抗體LM5檢測杉木管胞細胞壁半乳聚糖的分布，使用LSM880激光共聚焦掃描顯微鏡(卡爾蔡司光學有限公司，德國)進行圖像的獲取與處理。

1.2.2 木質部主要成分測定 將1.1中的材料置于干凈無菌的研缽中，液氮研磨成粉末，并利用Alpha1-4真空凍干機(Marin Christ，德國)于-60℃進行冷凍干燥，然后利用范式洗滌纖維法對木質部中的酸性木質素、纖維素和半纖維素進行測定[16]。

1.2.3 主要代謝成分的提取及衍生化 代謝物提取和衍生化的方法參考石江濤等[17]和張勝龍等[18]的報道并稍加改進，具體如下：準確稱取凍干粉50 mg于2 mL離心管中，加入1 400 μL 80%甲醇和25 μL 20 mg·mL-1核糖醇(內標物)；置于Vortex-Genie 2振蕩儀(Scientific industries, 美國)上振蕩5 min充分混勻，于SY超聲儀(新上海牌，上海)45℃恒溫超聲萃取1 h，然后12 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液于15 mL離心管中；置于N-EVAP氮吹儀(Organo mation associates Lnc,美國)上吹干后，加入150 μL 4℃預冷的甲氧氨基鹽酸鹽(20 mg·mL-1)溶液，密封后置于搖床上37℃、160 r·min-1孵育2.5 h；然后加入150 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺[N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluroacetamide, MSTFA]37℃、160 r·min-1孵育30 min；最后加入300 μL吡啶(色譜級)和10 mg無水硫酸鈉混勻靜止2 min，吸取400 μL衍生液并用有機相微孔濾膜(0.45 μm)過濾于氣相瓶中用于氣相色譜質譜(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)檢測。

1.2.4 色譜條件與質譜條件 利用GC-MS對代謝物進行測定，在ISQ氣質聯用儀(賽默飛世爾科技有限公司，美國)進行分析。色譜柱：TR-5 MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度：230℃；升溫程序：初始柱溫設為100℃保持3 min，以 2℃·min-1升至200℃后再以5℃·min-1升至300℃保持5 min；載氣流速：1.5 mL·min-1；進樣量：1 μL；分流比：15∶1。采用電子轟擊離子源，傳輸線溫度為250℃，離子源溫度為200℃，掃描范圍為40～600m/z，為確保衍生物能充分被離子化，設置2.5 min的溶劑延遲。

1.2.5 組分鑒定和相對定量方法 利用MS Workstation version 7.0軟件對質譜圖進行識別讀取，將測定所得的化合物與國家標準與技術研究所(National Institute of Standards and Technology，NIST)質譜庫進行全掃描匹配，相似度達80%以上并結合分子質量、分子結構以及質核比綜合分析后，確認該化合物的化學成分。代謝成分的含量計算采用面積歸一法，數值根據加入的內標含量計算。

1.3 數據分析

利用Excel 2019和SPSS 18.0軟件進行測定數據的平均值和標準差計算以及顯著性檢驗等分析，使用Origin 8.5和Photoshop CS6軟件進行圖表制作，參照劉振等[19]和羅欽等[20]的報道使用Simca 13.0軟件進行正交偏最小二乘(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)主成分分析。

2 結果與分析

2.1 杉木應壓木管胞細胞壁顯微結構特征

斜放處理30 d后，首先對杉木應壓木形成區域進行觀察，結果顯示，與對應木和直立木相比，杉木應壓木圓盤明顯不對稱且產生了紅棕色加厚區域(圖1)。進一步對應壓木的顯微結構進行觀察，發現應壓木次生木質部管胞壁明顯增厚，管胞多數為圓形或橢圓形，且細胞角隅胞間層(cell corner middle lamella, CCML)出現空腔(圖2-A)，而對應木和直立木的管胞主要是方形或多邊形，其CCML中無空腔(圖2-B～C)。對管胞細胞壁的木質素自發熒光進行檢測，結果表明在對應木和直立木中，較強的木質素熒光主要出現在CCML，證明該壁層中木質素含量較高；而在應壓木中，最強熒光信號則出現在靠近CCML的S2L(圖2-D)，顯示此處木質素含量最高，遠離CCML的壁層含量相對較低。使用多糖單克隆抗體LM5表位檢測應力木和直立木中的(1,4)-β-半乳聚糖分布，應壓木的S2L顯示出豐富的半乳聚糖表位(圖2-G)，對應木、直立木中則是稀疏地分布在S1中(圖2-H～I)。上述結果說明，相對于直立木和對應木，應壓木細胞壁中化學成分原位分布發生了明顯變化。3個時期的應壓木典型特征基本一致，因此下文僅放置一個時期的圖片。

注：A：斜放處理示意圖；B：直立木橫切面；C：應力木橫切面；CW：應壓木；OW：對應木；CK：直立木。

注：A～C：番紅染色；D～F：木質素自發熒光；G～I：LM5表位的免疫定位；CCML：細胞角隅胞間層；CML：復合胞間層；S1～S3：次生壁S1～S3層；S2L：次生壁S2層的外層。

對應壓木的雙壁厚進行測定，結果如圖3-A所示。應壓木木質部的雙壁厚極顯著大于直立木，但60～90 d增厚不明顯。

2.2 杉木應壓木中木質纖維素分析

化學成分分析結果表明，3個處理時間的應壓木木質素相對含量均極顯著高于對應木和直立木，但不同時期的應壓木間木質素含量無明顯差異(圖3-B)；60和90 d應壓木纖維素相對含量低于直立木，且低于同時期的對應木(圖3-D)，并隨著斜放時間的延長呈現下降趨勢；與木質素相同，同一時期應壓木半纖維素相對含量顯著高于直立木，并且隨斜放時間的增加呈現上升趨勢，但不同時期應壓木的半纖維素含量無顯著變化，除90 d時對應木中半纖維素相對含量顯著高于直立木，其他時期對應木與直立木無明顯變化(圖3-C)。

注：CW30～CW90分別表示處理30、60和90 d后的應壓木；OW30～OW90分別表示處理30、60和90 d后的對應木；CK30～CK90分別表示處理30、60和90 d后的直立木；*：相對于CK顯著；**：相對于CK極顯著。

2.3 杉木應壓木中差異代謝物的鑒定

利用GC-MS對杉木應壓木、對應木和直立木的木質部代謝成分進行檢測，結果均檢測到39個色譜峰(峰面積大于0.1%)(圖4)。對這39個色譜峰進行解譜分析，發現20個為已知的代謝成分(同分異構體算作一種)，其相對應的峰面積占到總峰面積的90%以上；此外，有7個峰未能得到鑒定。對檢測到的20種已知化合物進行分類，其中有機酸7種、單糖3種、二糖2種、糖苷類1種、醇類3種、酯類1種、氨基酸2種、酚類1種(表1)。譜圖鑒定發現2個松醇和果糖的指示峰，這些化合物含有多個取代三甲基的位點，在未完全衍生化情況下導致異構體的產生，在色譜圖上顯示為2個峰，質譜庫鑒定為同種化合物，因此定量分析時將其看作同一個峰。代謝譜顯示多個蔗糖的指示峰，由于其細小致密，分析時合并為一個峰處理。進一步分析這些代謝成分在不同樣本中的相對含量及變化規律可知，糖類物質含量較高，其中蔗糖相對含量個體最高可達到28.81%，其次是有機酸類和醇類，其他幾種化合物含量相對較少。

注：1：吡啶；2：吡啶；3：乙醇酸；4：纈氨酸；5：甘油；6：磷酸酯；7：硅烷醇；8：甘氨酸；9：蘋果酸；10：未知化合物；11：核糖醇(內標)；12：松醇；13：莽草酸；14：檸檬酸；15：奎寧酸；16：D-果糖；17：D-(-)-果糖；18：葡萄糖；19：半乳糖；20：核糖酸；21：未知化合物；22：松醇；23：棕櫚酸；24：肌醇；25：未知化合物；26：異海松酸；27：未知化合物；28、29：蔗糖；30：未知化合物；31：兒茶素；32：兒茶素；33：乳糖1；34：未知化合物；35：乳糖2；36：β-甲基-D-半乳糖苷1；37：未知化合物；38：蔗糖；39：β-甲基-D-半乳糖苷2。

表1 3個時期主要代謝成分的相對含量變幅

根據圖5結果對比應壓木和直立木在30、60和90 d的代謝化合物相對含量，發現在杉木斜放處理30 d后，16種化合物的比值大于1，表明應壓木中該化合物含量大于直立木中的含量。其中有10種化合物的相對含量比率，包括有機酸種類(蘋果酸、奎寧酸、莽草酸和棕櫚酸)、糖類(蔗糖和乳糖)、酚類(兒茶素)、兩種氨基酸和β-甲基-D-半乳糖苷，斜放30 d后高于斜放60 d，直至90 d應壓木含量低于直立木。屬于糖類的果糖(將兩種果糖合并為一種計算)、葡萄糖和半乳糖以及肌醇的相對含量比率在30 d時高達1.7以上，這幾種化合物在60和90 d的應壓木中雖然呈現下降趨勢，但仍然處于高于同時期直立木的水平。應壓木中乙醇酸在30和60 d低于直立木，90 d后含量略高于直立木。檸檬酸在3個時期均呈現應壓木低于直立木的水平。甘氨酸與核糖酸在3個時期呈現倒“V”型的分布規律，30 d應壓木中化合物含量與直立木相比無顯著變化，60 d比值大于1.5，90 d低于0.4。松醇和磷酸酯在3個時期無明顯變化。

圖5 杉木應壓木(CW)和直立木(CK)在30、60和90 d的相對含量比率

3 討論

3.1 杉木應壓木的解剖結構

應壓木是裸子植物偏離垂直方向生長時，為了抵抗重力吸引，在莖下部產生的一種具有特殊結構和成分的木材組織，被認為是研究木材形成的良好模型[21]。本研究利用該模型對杉木應壓木的木質部解剖特性和主要代謝成分變異規律進行了系統研究，結果表明杉木僅經30 d的斜放誘導處理后，應壓木木質部管胞壁顯著增厚，是直立木及對應木管胞雙壁厚的1.5倍，且出現木質化程度較高的S2L層，CCML處出現空腔，無S3層。該結果與馬尾松[22]、火炬松[23]、云南松[10]和日本柏樹[24]等眾多裸子植物的應壓木結構變化一致，皆是次生壁增厚，微纖絲夾角發生了改變，管胞出現螺紋裂痕，S3缺失。根據木質素自發熒光且熒光強度與木質素濃度呈線性正比的現象，利用高分辨熒光圖像檢測杉木不同壁層的木質素原位分布，本研究結果表明，相比對應木和直立木，應壓木S2L與S2層的木質素含量均有升高。已有用細胞壁成分有特異性的抗體對輻射松應壓木進行免疫雜交的研究，結果發現S2L層沉積了(1,4)-β-半乳聚糖，S2層出現阿拉伯半乳聚糖蛋白沉積，以及管胞螺紋裂隙周邊出現(1,3)-β-葡聚糖的沉積[6,25]。杉木的半纖維素表位與輻射松相似，S2L處沉積了(1,4)-β-半乳聚糖，對應木和直立木中僅在S1層周圍出現。縱向對比3個時期的應壓木變化，發現應壓木形成過程中的解剖變化不顯著，不同時期之間變化趨勢類似。

3.2 杉木應壓木形成中的化學成分含量變化

測定結果顯示，杉木應壓木雙壁厚隨斜放時間的增加逐漸增厚，而纖維素相對含量呈現下降趨勢，因此推測應壓木管胞次生壁增厚的原因極有可能與木質素以及半纖維素如半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖蛋白、葡聚糖等在S2外層異常沉積有關。對應木的雙壁厚雖然與直立木無明顯差異，但其木質素相對含量隨斜放時間的增加呈現下降趨勢，而纖維素相對含量則呈現上升趨勢(圖3)，由于對應木和應壓木來源于同一棵樹的對立兩邊，對應木的管胞壁顯微特征雖然與直立木無明顯差異，但其管胞次生壁化學成分在斜放誘導期間可能發生了與應壓木相反的變化。

3.3 杉木應壓木形成中主要代謝成分分析

在木材形成過程中，纖維素、木質素與半纖維素的合成涉及復雜的代謝途徑和代謝組分。通過對比應壓木和直立木的代謝譜，發現在木質部當中主要是糖類物質富集，表明木材形成是以糖代謝為主的木質纖維素生物合成。木質素的生物合成普遍認為可分為以下三個步驟：首先是光合作用后的同化產物到芳香氨基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等的合成過程，稱為莽草酸途徑；然后是從苯丙氨酸到羥基肉桂酸及其輔酶A酯類的合成過程，稱為苯丙酮酸途徑；最后是羥基肉桂基輔酶A酯類到木質素單體及其聚合物的過程，稱為木質素合成的特異途徑[26]。研究發現在莽草酸合成途徑中脫氫奎寧酸和莽草酸脫氫酶兩種酶相互融合，共同促進了莽草酸途徑的第3和第4個階段，增加了代謝物流通的效率[27]。蘋果酸參與植物體內多個代謝途徑，其中蘋果酸酶以蘋果酸為前體催化反應，為肉桂醇脫氫酶提供煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NAPDH)生成木質素單體[28]。因此，莽草酸、奎寧酸、蘋果酸是與木質素合成相關的代謝成分[29-30]。經過30 d的斜放誘導處理，杉木應壓木中的與木質素合成相關的物質如蘋果酸、奎寧酸、莽草酸相對含量高于同時期的直立木，證明應壓木木質化程度高于直立木(表1)。30 d應壓木木質素相關成分水平接近60 d的直立木，表明在應壓木形成的初期，代謝通量主要流向苯丙烷代謝途徑，此結果與30 d后應壓木中木質素含量迅速累積的現象一致。

碳水化合物包括半纖維素和纖維素，尿苷二磷酸葡萄糖(uridine 5′-diphospho glucose, UDPG)是纖維素與部分半纖維素生物合成的直接起始底物，其中半乳聚糖、半乳糖醛酸、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖和葡甘聚糖的合成，均以UDPG為前體通過不同途徑轉化成尿苷二磷酸木糖、阿拉伯糖、乳糖等為單體而構建[31-32]。已有研究表明半乳聚糖、甘露聚糖和木聚糖等多糖的分布與最終木質化程度有關[33]。本研究代謝譜解析結果顯示了杉木應壓木形成過程中半乳糖、葡萄糖等半乳聚糖和葡甘聚糖合成底物的增加，分析發現相比直立木以及30和60 d的應壓木，90 d后的應壓木的代謝產物主要富集了糖類物質。該現象與應壓木雙壁厚逐漸增厚、半纖維素含量逐漸增加相關，上述糖類物質可能是決定木質素沉積在管胞細胞壁各層中的位置和數量的控制因素。本試驗結果發現應壓木中果糖、蔗糖等糖類化合物的相對含量均隨斜放時間的增加而降低(圖5)，其中蔗糖在應壓木90 d后已下降至低于直立木的水平，而單糖物質果糖、葡萄糖和半乳糖仍處于高于直立木的水平，表明在應壓木90 d后，蔗糖酶與蔗糖合酶的表達極有可能仍處于上調水平，其將蔗糖轉化為葡萄糖與果糖，增加了UDPG與半纖維素合成的效率。這可能是由于木質素沉積的模式在生長季節保持不變，夏季木質化細胞數量達到峰值后逐漸降低造成的[33]。檸檬酸既能在基礎生命代謝中起中間產物的作用，又能改進應壓木的抗壓強度[34]。本試驗結果發現檸檬酸在3個時期均呈現低于直立木的水平(表1)，而與此相關的原因還未有相關結論，有待進一步研究。

4 結論

杉木應壓木形成中呈現出管胞變圓，S2L增生以及管胞次生壁增厚，木質素與半纖維素含量顯著增加等現象。GC-MS檢測到共有20種化合物，其中有機酸7種、單糖3種、二糖2種、糖苷類1種、醇類3種、酯類1種、酚類1種，應壓木中差異性代謝物相對含量顯著高于直立木。在應壓木形成初期，即30 d斜放處理誘導后，有機酸類和糖類物質大量在木質部累積，為木質素合成和細胞壁增厚提供了代謝中轉產物。當斜放誘導時間增長至90 d后，有機酸類物質含量下降至低于直立木的水平，為保證半纖維素的合成，單糖類物質的含量仍處于高于直立木的水平，表明木質素合成是應壓木形成初期的主要反應，半纖維素的合成速率則隨著誘導時間的延長而逐漸提高。