蜂王漿及其提取物對失眠小鼠的睡眠改善作用

蘭天，汪玲，余賢嫻，余春濤，姚虹，徐和迪，譚惠子*，聶少平

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，中國-加拿大食品學與技術聯合實驗室（南昌），江西省生物活性多糖重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西汪氏蜜蜂園有限公司，江西 南昌 330008）

睡眠是人類正常的生理活動，除了可以消除疲勞，使人產生新的活力外，還與提高免疫力、抵抗疾病的能力有著密切的關系。睡眠障礙通常與身心疾病相關，會造成疲勞、精神疾病，如抑郁癥等，甚至引起認知功能障礙，導致生活質量下降[1]，睡眠障礙還可能會對心臟功能、免疫功能和血糖調節產生負面影響[2]。研究發現，睡眠障礙會對生殖系統造成一定的影響，可能會造成月經不調、不孕等[3-4]。西醫主要依靠化學類藥物進行治療，如抗抑郁藥、巴比妥類藥物等[5]，雖然有一定療效，但成癮性高，依賴性強，長期服用還會產生一定的耐藥性或不良反應。

蜂王漿是由蜂群中的哺育工蜂的上顎腺等腺體分泌的乳白色或淡黃色乳狀液體，是蜂王幼蟲整個發育期和雄蜂幼蟲前期的唯一食物。蜂王漿略帶甜、酸、澀、辛辣味，并具有特殊香氣[6]，其成分非常復雜，且與蜂種、蜜源、產地、季節等因素相關[7-8]。許多研究表明，蜂王漿具有包括促進睡眠[9-10]、增強免疫力[11-12]、延緩衰老[13]、修復細胞和組織損傷[14-16]、抗氧化[17]、調節心血管系統[18]等在內的多種功能活性。有研究推測[9，19]，蜂王漿中的主要活性成分可能包括脂類物質如10-羥基-2-癸烯酸、蛋白類物質如蜂王漿主蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）以及小分子類物質，如維生素、氨基酸等。在MRJPs中，已發現有9種不同的組分，命名為MRJP1～MRJP9，其中分子量為55 kDa左右的MRJP1，含量最高且被認為具有良好的功能活性[20-22]。

對氯苯丙氨酸，又稱芬克洛寧，是色氨酸羥化酶（tryptophan-hydroxylase，TDH）的選擇性和不可逆抑制劑[23]，而 TDH 是 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）合成的限速酶。因此，對氯苯丙氨酸通過抑制色氨酸羥基化而阻斷5-HT的合成，可顯著降低腦內和血液中的5-HT濃度，從而引發失眠。對氯苯丙氨酸多用于動物失眠模型的建立，并被廣泛用于5-HT及其與其他神經遞質之間關系的研究[24]。本文以蜂王漿為原料，通過超濾透析、真空冷凍干燥、甲醇-二氯甲烷提取法等方法提取蜂王漿粗蛋白、蛋白類功能因子和脂類功能因子，并通過對氯苯丙氨酸構建失眠小鼠模型，結合睡眠實驗及腦組織和血液中神經遞質變化，探究蜂王漿及其功能組分提取物對小鼠睡眠質量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠（4周齡，雄性，156只，體質量16 g～20 g）：湖南斯萊克景達有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（湘）2020-0006。

1.1.2 原料與試劑

蜂王漿原漿、江西汪氏蜜蜂園有限公司；褪黑素：湯臣倍健股份有限公司；苯巴比妥鈉：上海上藥新亞藥業有限公司；對氯苯丙氨酸（4-chloro-DL-phenylalanine，PCPA）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；10-羥基-2-癸烯酸標準品、對羥基苯甲酸甲酯標準品、透析膜（8 000 Da～14 000 Da）：上海源葉生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）片劑：生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇（色譜純）：德國Merck公司；無水乙醇（優級純）：西隴科學股份有限公司；超濾管（截留分子量30 kDa）：美國Millipore公司；酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）測定試劑盒：武漢Elabscience生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204TE/02電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；LYNX4000高速離心機、ST16R高速離心機：美國Thermo Fisher Scientific公司；SHB-Ⅲ循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；PowerPac基礎電泳儀：美國Bio-Rad公司；e2695高效液相色譜儀：美國Waters科技有限公司；1260高效液相色譜儀：美國Agilent科技有限公司；FreeZone真空冷凍干燥機：美國Labconco公司；N1300旋轉蒸發儀：東京理化器械株式會社；spectraMAX190全自動酶標儀：美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂王漿中粗蛋白的提取

將蜂王漿原液按料液比1∶9（g/mL）溶于PBS中，在4℃條件下攪拌24 h后于12 000 r/min離心30 min，去除全部上清液，用截留分子量8 000 Da～14 000 Da的透析膜透析24 h后，通過真空冷凍干燥得粗蛋白提取物，使用BCA試劑盒測定提取物的蛋白質濃度，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法測定蛋白質組成及分子量范圍。

1.3.2 蜂王漿中蛋白類功能因子的提取

試驗方案參考文獻[25]，通過超濾透析、冷凍干燥得蛋白類功能因子提取物。使用BCA試劑盒測定提取物的蛋白質濃度，并采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）法和SDS-PAGE法測定蛋白質組成及分子量范圍。

1.3.3 蜂王漿中脂類功能因子的提取

參照文獻[26]的方法，采用二氯甲烷-甲醇法制備得到脂類功能因子提取物。參照國家標準GB 9697—2008《蜂王漿》，通過高效液相色譜法測定提取物中10-羥基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）含量。

1.3.4 動物實驗設計

動物實驗參照已有研究[27-29]進行優化，所有雄性昆明小鼠在標準條件下（溫度20°C～26°C，相對濕度40%～70%，白天與黑夜每12 h為一個循環）適應1周后，開始正式實驗。所有的小鼠隨機分為13組，每組12只，即空白組（B）、PCPA模型組（M）、褪黑素對照組（ME）、蜂王漿組（RJ）、粗蛋白提取物的低/中/高劑量組（CL/CM/CH）、蛋白類功能因子提取物的低/中/高劑量組（PL/PM/PH）及脂類功能因子提取物的低/中/高劑量組（AL/AM/AH），動物實驗設計如圖1所示。

圖1 動物實驗設計Fig.1 Animal experiment design

實驗期間小鼠可自由飲水攝食，第1天～2天，除空白組外所有小鼠每天腹腔注射300 mg/kg用弱堿性（pH8.0）生理鹽水配制的PCPA溶液[27]，連續注射2 d，建立失眠小鼠模型；然后對除空白組外所有小鼠繼續腹腔注射100 mg/kg PCPA溶液，連續2 d，鞏固失眠小鼠造模效果，空白組腹腔注射等體積弱堿性生理鹽水。

實驗第3天～7天，對除空白組和PCPA模型組外所有小鼠進行灌胃干預，每天1次。褪黑素對照組和蜂王漿組參照70 kg體質量的成年人每日最佳攝入量換算，褪黑素對照組（ME）小鼠灌胃0.39 mg/kg的褪黑素，蜂王漿組（RJ）小鼠灌胃637 mg/kg的蜂王漿原漿（相當于體質量70 kg成年人每日攝取4.9 g蜂王漿）；粗蛋白提取物的低/中/高劑量組（CL/CM/CH）小鼠分別灌胃60、120、240 mg/kg的粗蛋白提取物，蛋白類功能因子的低/中/高劑量3組（PL/PM/PH）小鼠分別灌胃44、88、176 mg/kg的蛋白類功能因子，脂類功能因子的低/中/高劑量組（AL/AM/AH）小鼠分別灌胃 13.1、26.2、52.4 mg/kg的脂類功能因子，灌胃體積為每10 g小鼠體質量灌胃100 μL，空白組與PCPA模型組小鼠則每天灌胃等體積的蒸餾水。全程監控記錄小鼠的體質量及精神狀態變化。實驗結束后，收集所有小鼠血清、腦組織及肝組織，于-80℃保存備用。同時，稱取小鼠腦及肝組織質量，通過其與小鼠體質量的比值計算器官指數。

1.3.5 檢測指標

1.3.5.1 改善睡眠實驗

實驗根據已有研究[30]的方法，稍有改動，具體如下：所有實驗均在溫度適宜、安靜環境下進行。小鼠末次灌胃30 min后給各組小鼠腹腔注射苯巴比妥鈉，將苯巴比妥鈉注射后至翻正反射消失的時間記為小鼠睡眠潛伏期，并以翻正反射消失至再次出現的時間記為小鼠睡眠時長，觀察各組小鼠睡眠潛伏期及睡眠時長的差異。

1.3.5.2 生化指標檢測

采用相應ELISA試劑盒，根據說明書，分別測定血清中5-HT、多巴胺（dopamine，DA）以及腦組織中去甲狀腺腎上腺素（norepinephrine，NE）濃度。

1.4 數據分析

試驗數據分析采用GraphPad Prism軟件及雙尾T檢驗方法，若p值小于0.05則認為數據差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 蜂王漿粗蛋白、蛋白類功能因子及脂類功能因子提取物含量及分子量

本試驗獲得的蜂王漿粗蛋白中蛋白質的相對含量約為79.42%，其中以分子量為50 kDa～60 kDa及35 kDa～45 kDa的蛋白質組分為主。蛋白類功能因子提取物中分子量為50 kDa～60 kDa組分的相對含量為93.08%。脂類功能因子提取物中10-HDA的相對含量為43.85%。

2.2 小鼠體質量增長率

實驗過程中小鼠體質量變化見圖2。

圖2 小鼠實驗中的體質量增長率Fig.2 Body weight growth in mouse experiments

如圖2所示，所有小鼠體質量在整個實驗過程中均有不同程度的增加，其中PCPA模型組比空白組小鼠的體質量增長率低，粗蛋白提取物高劑量及脂類功能因子低劑量組小鼠的體質量增長率趨近于空白組。小鼠體質量增長率結果表明，PCPA給藥造模后的小鼠出現了體質量增長減緩的趨勢，但無顯著性差異，說明本實驗PCPA造模可以模擬中輕度的失眠體征。

2.3 小鼠器官指數

小鼠腦組織及肝臟的器官指數見圖3。

圖3 小鼠的腦器官指數和肝器官指數Fig.3 Brain organ index and liver organ index in mice

如圖3所示，與空白組比較，PCPA模型組小鼠的腦、肝臟器官指數均有所增加；脂類功能因子低劑量組小鼠腦、肝臟器官指數相比模型組均有所減少，趨近于空白組。小鼠器官指數結果表明，PCPA造模之后的小鼠出現了各器官指數上升的趨勢，但無明顯差異，說明本實驗PCPA造模未造成小鼠明顯器質性病變；蜂王漿及其各提取物組分對失眠小鼠器官指數上升表現出恢復的趨勢，說明了蜂王漿及其各提取物組分的安全性。

2.4 改善睡眠實驗

2.4.1 各組小鼠睡眠潛伏期時間

各組小鼠睡眠潛伏期時間見圖4。

圖4 各組小鼠的睡眠潛伏期時間Fig.4 Sleep latency of mice in each group

如圖4所示，PCPA模型組小鼠睡眠潛伏期時間相較于空白組有極顯著性差異（p<0.01），說明PCPA建立小鼠失眠模型成功。除蛋白類功能因子低劑量組外，其他組小鼠的睡眠潛伏期都顯著短于PCPA模型組，其中蜂王漿組、粗蛋白低劑量組和脂類高劑量組小鼠的睡眠潛伏期相比其它干預組更短，與模型組相比，差異高度顯著（p<0.001）。蛋白類功能因子及脂類功能因子組小鼠的睡眠潛伏期隨著干預劑量的增加表現出遞減的趨勢。

2.4.2 各組小鼠睡眠時間

各組小鼠睡眠時間見圖5。

圖5 各組小鼠睡眠時間Fig.5 Sleep duration of mice in each group

如圖5所示，與空白組比較，PCPA模型組小鼠的平均睡眠時間減少；蜂王漿組小鼠的平均睡眠時間得到恢復，并且脂類功能因子組小鼠的平均睡眠時間相比模型組和其他干預組更長，趨近于褪黑素的效果。

2.5 蜂王漿及其提取物對PCPA致失眠小鼠神經遞質的影響

2.5.1 5-羥色胺（5-HT）

各組小鼠血清中5-HT的濃度見圖6。

圖6 各組小鼠血清中5-HT含量Fig.6 Content of 5-hydroxytryptamine(5-HT)in serum of mice in each group

如圖6所示，與空白組相比，PCPA模型組小鼠血清中5-HT濃度極顯著下降（p<0.01）。5-HT是重要的腦內單胺類遞質，與認知功能、機體的睡眠和疲勞密切相關[31-32]，隨著睡眠剝奪時間延長，進入腦內的色氨酸增加，5-HT合成也增加，腦內5-HT濃度升高，機體會出現疲勞感和睡意[33]。本實驗結果驗證了PCPA作為色氨酸羥化酶抑制劑，能夠阻斷5-HT的合成，進而導致小鼠單胺類神經遞質紊亂，引起失眠。

經過蜂王漿及不同劑量的不同蜂王漿組分干預后，5-HT濃度均有明顯提高。其中，粗蛋白提取物的低、中劑量，蛋白類功能因子高劑量以及脂類功能因子組小鼠血清中5-HT濃度相對較高（p<0.001）；表明蜂王漿及其提取物可通過調節小鼠血清中5-HT濃度，從而達到改善睡眠的作用。

綜上實驗結果發現，脂類功能因子提取物相比于粗蛋白提取物和蛋白類功能因子提取物，對失眠小鼠的睡眠潛伏期時間、睡眠時間及血清中5-HT濃度的改善效果相對更好。除了5-HT，去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）也是與調節睡眠相關的重要神經遞質，因而后續通過腦組織中NE和血清中DA的濃度變化，進一步探討蜂王漿改善睡眠的物質基礎。

2.5.2 去甲腎上腺素（NE）

各組小鼠腦組織中NE的濃度見圖7。

圖7 各組小鼠腦組織中NE濃度Fig.7 Content of norepinephrine(NE)in brain tissue of mice in each group

如圖7所示，PCPA模型組小鼠腦組織NE濃度較空白組顯著上升（p<0.05）。NE負責神經元之間的溝通，并在注意力、情緒、睡眠等方面扮演重要角色，NE增加可獲得食物能量儲存，并能提高大腦的醒覺度[34-35]。蜂王漿組及脂類功能因子提取物均可下調小鼠腦組織NE的平均濃度，趨近于空白組，特別是低劑量脂類功能因子的效果最為顯著（p<0.05）。

2.5.3 多巴胺（DA）

各組小鼠血清中DA的濃度見圖8。

圖8 各組小鼠血清中DA含量Fig.8 Content of dopamine(DA)in serum of mice in each group

如圖8所示，PCPA模型組小鼠血清DA濃度較空白組高度顯著降低（p<0.001），DA是第一個被驗證在中樞疲勞中起作用的神經遞質。研究證實，PCPA可能會導致血清中的DA顯著降低[36]，并且血清DA缺乏可能與血清素缺乏有關的情緒問題發生率呈正相關[37]。經蜂王漿干預后小鼠血清DA濃度得到極顯著恢復（p<0.01），脂類功能因子提取物低、中、高劑量均能顯著提高小鼠血清DA濃度，并且呈現出劑量依賴的趨勢。

3 結論

本研究采用腹腔注射PCPA構建睡眠剝奪小鼠模型，研究蜂王漿及其蛋白、脂質提取物對睡眠潛伏期、睡眠時間及神經遞質水平的調節作用。結果顯示，蜂王漿原漿、粗蛋白組分、蛋白類功能因子組分及脂類功能因子組分能夠顯著縮短失眠小鼠睡眠潛伏期，上調5-羥色胺濃度。同時，脂類功能因子干預對小鼠睡眠時間的延長效果最好，并且脂類功能因子干預還能明顯改善DA及NE濃度異常，對小鼠失眠相關的神經遞質紊亂具有更好的改善作用。

綜上所述，蜂王漿中發揮促睡眠作用的主要功效成分可能為脂類提取物，蛋白類功能因子能夠發揮一定的協同作用。該研究結果為蜂王漿及其提取物在改善睡眠的作用機制及其應用提供參考依據。