合成硒代谷胱甘肽釀酒酵母菌株的篩選與發酵優化

何家偉，蔡俊

（發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵湖北省協同創新中心，工業微生物湖北省重點實驗室，湖北工業大學，湖北 武漢 430068）

硒是動植物必須的營養元素[1]。含硒化合物是癌癥治療中的抗氧化劑和化學預防劑[2-5]。

在富硒釀酒酵母菌體內存在多種有機硒，其中包括一種具有補硒、抗癌潛力的硒肽物質—硒代谷胱甘肽[6]。硒代谷胱甘肽（selenogutathione，GSeH）由 L-谷氨酸、L-硒代半胱氨酸（L-selenocysteine，Sec）和甘氨酸經肽鍵脫水縮合而成，是一種在生物體中含量很低的非蛋白類硒基化合物，通常分布于各種富硒植物和富硒菌體中[7-8]。GSeH的高抗氧化能力取決于其合成前體Sec。Sec被證明是各種重要抗氧化硒酶中的關鍵氨基酸[9-15]，這些硒酶通過活性位點處的Sec殘基有效減少了過氧化物[16]。在氧化應激條件下，自由基物種對蛋白質和其他大分子的氧化可被抗氧化劑化合物調節[17]。谷胱甘肽修復溶菌酶中的色氨酸自由基的速率常數為（1.05±0.05）×105L/（mol·s），而硒代谷胱甘肽修復色氨酸和酪氨酸自由基的速度較谷胱甘肽快約3個數量級[18]。可見硒代谷胱甘肽在抗氧化能力上遠遠高于谷胱甘肽。GSeH的高抗氧化能力及補硒功能在制藥行業有著巨大的潛力。

酵母富硒發酵過程中，培養基硫硒比對菌體的富硒和生長有很大影響，合適的硫硒比在硒代谷胱甘肽的發酵生產中尤為關鍵[19]。硒與硫在菌體吸收過程中處于競爭關系，但硒源和硫源充足的情況下，菌體優先吸收硫元素。因此，適當降低生長環境中硫元素的含量，菌體在滿足生長的前提下會吸收更多的硒，并將其轉化為有機硒。過高的硫含量會使試驗菌株更多地合成谷胱甘肽而非硒代谷胱甘肽，低硫培養的方法能夠極大程度上增加硒代谷胱甘肽產量。現國內已有較多篩選富硒釀酒酵母菌種的研究[20-23]，但對合成特定硒代產物的釀酒酵母篩選研究較少。本文以19株釀酒酵母為出發菌株，通過耐硒馴化、硫酸二乙酯（diethyl sulphate，DES）誘變、乙硫氨酸抗性篩選以及添硒低硫培養優化，成功得到一株富硒能力優良的菌株，可利用生物轉化途徑將無機硒轉化得到GSeH，并對其發酵進行優化，以期為開發富硒產品提供一種安全的抗氧化有機硒源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

19株釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae分別為CGY、CGY2、CCCG、CCY、CLS、CHY、CEPY、CBY、CGWY、CKY、GAQ4、CMY、JYYR、CRY、GAQ1、XHV-25、GAQ2、JYYJS、BDYD：湖北工業大學實驗室保藏菌株。

1.1.2 試劑和培養基

培養基：酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養基、YEPD固體培養基、無氨基酵母氮培養基和無硫酵母氮源基礎培養基（yeast nitrogen base，YNB）培養基。

亞硒酸鈉、硫酸二乙酯、硝酸、高氯酸、甲酸、3，3-二氨基聯苯胺、乙硫氨酸、庚烷磺酸鈉、乙腈、三氟乙酸（tallow fatty acid，TFA）、氮乙酰半胱氨酸：美國 Sigma-Aldrich公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AR1140電子分析天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；ZSD-1270全自動生化培養箱、ZHWY-2012C恒溫振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；YXQ-LS-75211立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司；3K15低溫高速離心機：美國Sigma公司；JY92-11超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；BSC系列生物安全柜：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；MX-S可調式混勻儀：北京大龍儀器有限公司，Waters QDa MS質譜儀、Waters 2545高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

將19株釀酒酵母菌分別接入100 mL YEPD液體培養基中，于30℃、180 r/min恒溫搖床中活化24 h。

1.3.2 Na2SeO3抗性篩選

將Na2SeO3溶液過濾除菌，加入到滅菌后尚且呈液體狀態的YEPD固體培養基中搖勻以保證混合均勻。Na2SeO3濃度按200、400、600 mg/L等梯度遞增至3 000 mg/L。選出在高硒濃度下能夠生長且菌落較大的菌株，進行馴化培養。

1.3.3 富硒釀酒酵母的馴化培養

將篩選出的酵母菌株接種于裝有50mL含50 mg/L Na2SeO3的YEPD培養基中，30℃、180 r/min下培養。每24 h吸取5 mL菌液轉接于含50 mg/L Na2SeO3的新鮮YEPD培養基中，連續轉接培養90次。

1.3.4 DES誘變

取馴化培養后的釀酒酵母加入YEPD培養基，30℃、180 r/min下培養，取對數生長初期的釀酒酵母發酵液于8 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗3次，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）制成菌懸液。加入1%DES，于30℃、180 r/min培養60 min，之后加入硫代硫酸鈉溶液終止反應，離心去上清液，蒸餾水清洗3次，用于下一步抗性平板涂布。

1.3.5 乙硫氨酸抗性篩選

將濾膜除菌后的乙硫氨酸加入到滅菌后尚且呈液體狀態的YNB固體培養基中混勻，乙硫氨酸濃度按2、4、6、8、10 mg/L。將 DES 誘變后的菌株加入 5 mL YEPD培養基，培養16 h后離心收集菌體，蒸餾水清洗3次后，稀釋涂布于乙硫氨酸抗性平板。同時對未誘變處理的酵母培養液進行稀釋涂布于該平板上，取在乙硫氨酸最高抗性平板上長出的菌落，在無硫YNB培養基上進一步驗證。

1.3.6 發酵條件的單因素優化試驗

采用單因素試驗探究發酵溫度、亞硒酸鈉添加時間、初始pH值、搖床轉速、接種量、裝液量對釀酒酵母菌株CMY-15-1發酵硒代谷胱甘肽產量的影響。每組試驗做3次平行。

1.3.7 發酵培養基單因素優化試驗

采用單因素法優選CMY-15-1菌株產硒代谷胱甘肽的培養基條件，探究最優碳源、最優氮源、最優無機鹽和最優亞硒酸鈉添加量等條件。每組試驗做3次平行。

1.3.8 應用于生物過程優化的統計學方法

1.3.8.1 Plackett-Burman（PB）試驗設計

根據上述試驗結果，選取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二鉀、氯化銨、氯化鎂、氯化鈣、亞硒酸鈉8個成分，用Design-Expert軟件設計PB試驗表，篩選出對CMY-15-1菌株產硒代谷胱甘肽影響比較顯著的因素。發酵條件為優化后的試驗條件。

1.3.8.2 最陡爬坡試驗

以PB設計試驗篩選出的顯著性因素為基礎，對其最佳值區域進行確定，為后續的中心復合設計提供試驗依據。依據顯著性因素的正負效應，設計合理的步長，增加試驗的密集度，設計最陡爬坡試驗表。發酵條件為優化后的試驗條件。

1.3.8.3 中心復合設計（central composite design，CCD）結合響應面試驗設計

根據PB試驗和最陡爬坡試驗結果，采用三因素五水平的CCD優化試驗來確定CMY-15-1產硒代谷胱甘肽的最佳培養基組成。

1.3.9 釀酒酵母生物量的測定

發酵液于8 000 r/min離心10 min，蒸餾水清洗3次后收集菌體，80℃烘干至恒重，釀酒酵母生物量=釀酒酵母菌體質量/發酵液體積。

1.3.10 有機硒測定

烘干硒酵母樣品有機硒含量按照GB 5009.93—2017《食品安全國家標準食品中硒的測定》中熒光分光光度法進行檢測。

1.3.11 高效液相色譜與質譜聯用測定谷胱甘肽和GSeH含量

取發酵后的菌體進行破壁處理，取破壁前后菌體用血球板計數法測定破壁率。破壁后離心取上清液并過0.22 μm濾膜。取谷胱甘肽標品作標準曲線（以谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標），測定谷胱甘肽含量。利用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）質譜通過SIR模式標定特征分子量355表征硒代谷胱甘肽出峰時間。CMY-15-1內不含有N-乙酰-半胱氨酸，其具有硒代谷胱甘肽類似的結構且出峰時間與被檢測物不重疊，可用其作為內標物，以峰面積作為參照指標，用于定量樣品內硒代谷胱甘肽含量。

高效液相色譜條件：inertsil ODS-VPC18柱（4.6mm×250 mm，5 μm），柱溫為 25 ℃，進樣量 20 μL。流動相為乙腈-TFA-水溶液，流量0.6 mL/min；梯度洗脫程序為 0～3 min 乙腈-TFA-水溶液（體積比 1.0∶0.1∶98.9），3 min～10 min 乙腈-TFA-水溶液（40.0∶0.1∶59.9），10 min～15min 乙腈-TFA-水溶液（體積比 1.0∶0.1∶98.9）。

質譜條件：電噴霧電離源正離子模式ESI+，選擇監測模式Scan，噴霧電壓5.5 kV，霧化氣流量15 L/h，離子源溫度500℃，錐孔電壓15 V，碰撞氣體為氮氣，數據采集掃描時間20 ms。

1.4 數據處理

數據用Origin 8.0軟件、Design Expert 10進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 耐硒酵母菌株篩選及馴化

硒標準曲線見圖1，耐硒酵母馴化與未馴化菌株的生物量和有機硒含量比較見表1。

圖1 四價硒標準曲線Fig.1 Standard curve of tetravalent selenium

表1 耐硒酵母馴化與未馴化菌株的生物量和有機硒含量比較Table 1 Comparison of biomass and organic selenium content of Se-tolerant yeast with and without Se-tolerant strains

由表1可知，對19株釀酒酵母菌株進行耐硒篩選，得到4株釀酒酵母菌株能在濃度3 000 mg/L Na2SeO3的YEPD固體培養基中生長，分別是CMY、JYYR、BDYD和XHV-25。在經過耐硒馴化培養后，馴化菌株CMY-1、JYYR-1、BDYD-1和 XHV-25-1 和原菌株于200 mg/L Na2SeO3YEPD培養基發酵24 h，其合成有機硒能力和生物量均有所提高。其中CMY-1產有機硒能力最強，較未馴化CMY有機硒含量提高165.6%，比XHV-25高出4.75倍。具有高耐硒能力的菌株，其積累硒的能力和將無機硒轉化為有機硒能力都較強[24]。

2.2 DES誘變結果

DES誘變后與出發菌株的生物量和有機硒產量比較結果見表2。

表2 DES誘變后與出發菌株的生物量和有機硒產量比較Table 2 Comparison of biomass and organic selenium yield between DES mutagenesis and original strain

2.3 乙硫氨酸抗性篩選結果

谷胱甘肽標準曲線見圖2，CMY-15-1破壁上清液高效液相色譜圖見圖3，CMY-15-1破壁上清液質譜圖見圖4。乙硫氨酸抗性篩選后與出發菌株的GSH和GSeH含量比較結果見表3。

圖2 谷胱甘肽標準曲線Fig.2 Standard curve of glutathione

圖3 CMY-15-1破壁上清液高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography diagram of CMY-15-1 wall broken supernatant

圖4 CMY-15-1破壁上清液質譜圖Fig.4 Mass Spectrometry diagram of CMY-15-1 wall broken supernatant

表3 乙硫氨酸抗性篩選后與出發菌株的GSH和GSeH含量比較Table 3 Comparison of GSH and GSeH contents after screening for ethionine resistance with those of the original strain

由表3可知，相較未篩選前，谷胱甘肽含量提高60.4%。谷胱甘肽在釀酒酵母內由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylsysteine synthetase，γ-GCS）GSH1 和谷胱甘肽合成酶（glutashione synthetase，GS）GSH2 催化合成，GSH1是該反應的調節酶，受終產物谷胱甘肽反饋抑制。乙硫氨酸是谷胱甘肽合成途徑中的前體類似物[25]，其能與GSH1酶相結合，卻又不能參與蛋白質合成，其在胞內濃度不會下降，因此GSH1酶無法恢復正常酶活，使菌體無法合成谷胱甘肽。通過誘變后乙硫氨酸抗性篩選得到的釀酒酵母菌株，能在很大程度上解除谷胱甘肽對GSH1的反饋抑制，從而提高谷胱甘肽的產量。硒是硫的類似物，硒和硫在釀酒酵母體內的代謝途徑是相似的[26]，該抗性篩選同樣也能增加胞內GSeH的積累。

2.4 發酵條件的單因素優化

發酵條件單因素試驗結果見圖5～圖10。

圖5 發酵溫度對CMY-1-15菌株GSeH產量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖6 亞硒酸鈉添加時間對CMY-1-15菌株GSeH產量的影響Fig.6 Effect of sodium selenite addition time on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖7 pH值對CMY-1-15菌株GSeH產量的影響Fig.7 Effect of pH on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖8 轉速對CMY-1-15菌株GSeH產量的影響Fig.8 Effect of rotational speed on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖9 接種量對CMY-1-15菌株GSeH產量的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖10 裝液量對CMY-1-15菌株GSeH產量的影響Fig.10 Effect of liquid loading amount on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

由圖5可知，當發酵溫度為32℃時，硒代谷胱甘肽的產量達到最大值，為8.76 μg/L。故選擇32℃為最佳發酵溫度。由圖6可知，不同發酵時段添加亞硒酸鈉，硒代谷胱甘肽的產量也不同，當發酵時長5 h時添加亞硒酸鈉，硒代谷胱甘肽的產量達到最大值，為9.73 μg/L，故選擇發酵5 h添加亞硒酸鈉為最佳添加亞硒酸鈉時間。由圖7可知，當初始pH6.0時，硒代谷胱甘肽的產量達到最大值，為9.95 μg/L，此后，隨著初始pH值的升高，硒代谷胱甘肽的產量反而會降低，故最佳初始pH值為6.0。由圖8可知，當搖床轉速達到200 r/min時，硒代谷胱甘肽的產量達到最大值，為10.50 μg/L，故最佳搖床轉速為200 r/min。由圖9可知，當接種量為7%時，硒代谷胱甘肽的產量達到最大值為11.13 μg/L，故選擇最佳接種量為7%。由圖10可知，當裝液量為75 mL時，硒代谷胱甘肽的產量達到最大值，為11.38 μg/L，故選擇最佳裝液量為75 mL。

2.5 發酵培養基的優化

發酵條件培養基優化結果見圖11～圖18，復合氮源對硒代谷胱甘肽產量的影響結果見表4。

圖11 碳源種類對GSeH產量的影響Fig.11 Effects of carbon source types on GSeH yield

圖12 最優碳源添加量對GSeH產量的影響Fig.12 Effect of optimal carbon source addition on GSeH yield

圖13 有機氮源種類對GSeH產量的影響Fig.13 Effect of organic nitrogen source types on GSeH yield

圖14 無機氮源種類對GSeH產量的影響Fig.14 Effect of inorganic nitrogen source types on GSeH yield

由圖14可知，當發酵培養基無機氮源為氯化銨時，胞內硒代谷胱甘肽產量最高為7.38 μg/L，故選擇氯化銨為最佳無機碳源。

圖15 蛋白胨添加量對GSeH產量的影響Fig.15 Effect of peptone dosage on GSeH yield

圖16 Na2SeO3添加量對GSeH產量的影響Fig.16 Effect of Na2SeO3addition on GSeH yield

圖17 無機鹽種類對GSeH產量的影響Fig.17 Effects of inorganic salts on GSeH yield

圖18 酵母粉添加量對GSeH產量的影響Fig.18 Effect of yeast powder addition on GSeH yield

表4 復合氮源對硒代谷胱甘肽產量的影響Table 4 Influence of compound nitrogen source on selenoglutathione yield

由圖11可知，當發酵培養基碳源為葡萄糖時，胞內硒代谷胱甘肽產量最高為11.25 μg/L，故選擇葡萄糖為最佳碳源。

由圖12可知，當葡萄糖添加量達到35 g/L時，硒代谷胱甘肽產量達到最大值為14.38 μg/L，故選擇葡萄糖最佳添加量為35 g/L。

由圖13可知，當發酵培養基有機氮源為蛋白胨時，胞內硒代谷胱甘肽產量最高為11.29 μg/L，故選擇蛋白胨為最佳有機碳源。

由圖15可知，當蛋白胨添加量為10 g/L時，硒代谷胱甘肽產量最大，為19.55 μg/L。隨著蛋白胨添加量的逐漸增加，硒代谷胱甘肽產量隨之降低，硫元素和硒元素在釀酒酵母細胞內是一種代謝競爭關系，當環境中大量存在硫元素時，釀酒酵母會更傾向于吸收利于細胞生長的含硫物質，不利于有機硒類物質的合成。硫作為各種蛋白質和酶類物質的關鍵元素，缺少硫元素卻會使菌株難以大量生長。故發酵培養基需要選擇合適的硫硒比，在不影響菌株生長的情況下，盡可能的合成更多的硒代谷胱甘肽。

有機氮源往往都含有不少硫元素，此時可以選擇無機氮源和有機氮源作為復合氮源。由表4可知，利用蛋白胨和氯化銨作為復合氮源，蛋白胨10 g/L，氯化銨7 g/L時，此時硒代谷胱甘肽產量最高為27.33 μg/L。

由圖16可知，當亞硒酸鈉添加量達到150 mg/L時，硒代谷胱甘肽產量達到最大值為28.73 μg/L。相關文獻表明[27]，亞硒酸鈉對菌株有一定毒性，添加過多的無機硒會導致菌株生長量下降，并在同時菌體會產生一種應激機制，將有機硒代謝為對菌體無害的單質硒。故硒代谷胱甘肽產量趨勢為先上升后下降。

由圖17可知，磷酸氫二鉀、氯化鎂、氯化鈣都能較好的促進CMY-15-1菌株產硒代谷胱甘肽，硒代谷胱甘肽產量分別為 26.34 μg/L、26.93 μg/L、26.56 μg/L。故選擇磷酸氫二鉀、氯化鎂、氯化鈣作為無機鹽進行后續Plackett-Burman設計試驗。

由圖18可知，隨著酵母粉添加量的提高，硒代谷胱甘肽的產量也逐漸提高，當酵母粉添加量達到8 g/L時，硒代谷胱甘肽產量達到最大值為31.43 μg/L。因為酵母粉中也同樣含有較多的硫元素，與硒元素產生代謝競爭，但同時酵母粉中又含有大量微量元素，這對菌株的生長起到至關重要的作用，故硒代谷胱甘肽產量趨勢為先上升后下降。

2.6 應用于生物過程優化的統計學方法

2.6.1 PB設計試驗

本試驗以上述碳源、氮源和金屬離子優選試驗結果為基礎，對影響釀酒酵母CMY-15-1菌株產硒代谷胱甘肽的因素進行考察，這些因素分別是葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二鉀、氯化銨、氯化鎂、氯化鈣、亞硒酸鈉。使用Plackett-Burman試驗設計考察8個組分的重要性，每個因素取高低兩個水平，每組試驗做3次平行，PB試驗用Design-Expert軟件設計如表5。

表5 PB設計試驗因素與水平Table 5 Factors and levels of PB design test

通過對上述試驗的結果進行分析，可以基本確定PB試驗所需的培養基組分，然后通過PB試驗篩選得到培養基對釀酒酵母菌株CMY-15-1產硒代谷胱甘肽有顯著性影響的組分，以便對培養基的組分進行進一步優化。按照軟件設計PB試驗，試驗12次，每組3個平行，按照表5中的組分配制培養基進行發酵試驗，測定硒代谷胱甘肽含量，試驗結果見表6～表8。

表6 PB設計試驗結果Table 6 Results of PB design test

表7 PB設計試驗的回歸分析Table 7 Regression analysis of the PB design test

表8 PB設計試驗的方差分析Table 8 Analysis of variance for the PB design test

由表7和表8可知，該試驗設計的回歸模型的P值（prob＞F）＜0.05，表明該模型顯著。蛋白胨、亞硒酸鈉和氯化銨的P值在95%的置信區間內是小于0.05的，說明蛋白胨、亞硒酸鈉和氯化銨這3種培養基組成成分是影響釀酒酵母CMY-15-1產硒代谷胱甘肽的主要因子，確定此3個因素為響應面試驗的3個試驗變量。其中蛋白胨為負效應，亞硒酸鈉、氯化銨為正效應。該模型顯著，其決定系數R2=0.986 6，說明此模型中98.66%的變量可通過此模型來解釋。

2.6.2 最陡爬坡試驗

根據PB設計試驗得到影響釀酒酵母CMY-15-1菌株產硒代谷胱甘肽的顯著因素，其中蛋白胨為負效應，亞硒酸鈉、氯化銨為正效應，按照各因素正負效應來設定最陡爬坡試驗。最陡爬坡試驗設計見表9。

表9 最陡爬坡試驗設計Table 9 Test design of steepest climb

由表9可知，當蛋白胨、亞硒酸鈉、氯化銨添加量為7 g/L、180 mg/L、8.2 g/L時，釀酒酵母菌株CMY-15-1產硒代谷胱甘肽含量最高，達到31.32 μg/L，將其作為中心復合試驗的中心點，進一步優化組分添加量。

2.6.3 中心復合設計試驗

通過最陡爬坡試驗得到中心點為蛋白胨添加量7 g/L，亞硒酸鈉添加量180 mg/L，氯化銨8.2 g/L，以此為中心點以硒代谷胱甘肽產量為響應值進行三因素五水平的中心復合設計試驗，各因素水平如表10所示。

表10 CCD設計試驗的因素與水平Table 10 Factors and levels of CCD design test

以試驗結果表中的硒代谷胱甘肽作為相應量，利用軟件Design-Expert構建二次式模型，模型方程為R1=30.72-4.28A+2.30B+1.22C-1.24AB-0.84AC+0.34BC-3.86A2-2.63B2-1.83C2，其中R2=0.9955。由二價多項式分析表可知方程中 A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2各項的 P 值均小于0.05。這說明以上各項對CMY-15-1菌株產硒代谷胱甘肽有顯著性影響。失擬項檢驗值為0.107 1＞0.05，這說明模型能與數據準確擬合。

表11 CCD設計試驗與結果Table 11 CCD design test and results

表12 二價多項式回歸分析Table 12 Regression analysis of divalent polynomial

經回歸方程的方差分析結果驗證表明，模型的P值＜0.05，方程具有統計學上的顯著性，說明該模型與試驗值擬合較好，適用于CMY-15-1產硒代谷胱甘肽的理論預測。蛋白胨和亞硒酸鈉、蛋白胨和氯化銨之間存在顯著交互作用，通過軟件對回歸方程中AB、AC交互項繪制響應面分析圖，見圖19～圖20。

圖19 蛋白胨和Na2SeO3的交互作用對CMY-15-1產硒代谷胱甘肽的影響Fig.19 Effect of the interaction of peptone and Na2SeO3on the production of selenoglutathione by CMY-15-1

圖20 蛋白胨和NH4Cl的交互作用對CMY-15-1產硒代谷胱甘肽的影響Fig.20 Effect of the interaction of peptone and NH4Cl on the production of selenoglutathione by CMY-15-1

由模型和軟件分析可知蛋白胨5.46 g/L，亞硒酸鈉205.9 mg/L，氯化銨9.56 g/L為最佳添加量。在此預測最優培養基組分下硒代谷胱甘肽產量為33.46 μg/L。

2.6.4 驗證試驗

用CCD設計試驗得到的最佳培養基組成：蛋白胨5.46 g/L、亞硒酸鈉205.9 mg/L、氯化銨9.56 g/L、葡萄糖35 g/L，酵母粉8 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，氯化鎂0.5 g/L，氯化鈣0.5 g/L做3次重復試驗，平均硒代谷胱甘肽產量 33.71 μg/L。實測值與回歸方程預測值（33.46 μg/L）吻合良好。

3 結論

本研究利用實驗室19株釀酒酵母作為起始菌株，通過耐硒馴化、DES誘變和乙硫氨酸抗性篩選，獲得了一株富硒能力強的菌株CMY-15-1，其有機硒含量達到2 663.3 μg/g。單因素試驗確定CMY-15-1最佳發酵條件為發酵溫度32℃、亞硒酸鈉添加時間為發酵后5 h、初始 pH6.0、搖床轉速 200 r/min、接種量 7%、裝液量75 mL。在最優發酵條件下，通過單因素試驗篩選出最佳碳源、有機氮源和無機氮源、無機鹽等成分，并優化了亞硒酸鈉添加量。通過PB設計試驗有效篩選出對釀酒酵母CMY-15-1產硒代谷胱甘肽有顯著性影響的成分，通過最陡爬坡試驗，確定培養基中這些組分的添加量，最后由中心復合設計試驗得到最佳發酵培養基組成為蛋白胨5.46 g/L、亞硒酸鈉205.9 mg/L、氯化銨9.56 g/L、葡萄糖35 g/L、酵母粉8 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、氯化鎂0.5 g/L、氯化鈣0.5 g/L，測得硒代谷胱甘肽含量為 33.71 μg/L，預測值為 33.46 μg/L，結果相差不大，說明采用上述一系列優化方法得到的試驗結果是合理可靠的，優化后的硒代谷胱甘肽產量是優化前的3.94倍左右。

在本試驗中，過高的硫含量會使試驗菌株更多的合成谷胱甘肽而非硒代谷胱甘肽，復合氮源低硫培養的方法能夠極大程度上增加硒代谷胱甘肽產量。這為富硒釀酒酵母菌種發酵生產硒代谷胱甘肽提供了一定的理論依據。