菌酶協同水解玉米漿制備植物蛋白調味液工藝優化

王曉燕，劉曉蘭*，劉井權，鄭喜群，3

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163000）

玉米漿是濕法生產玉米淀粉的副產物，是價格低、產量高、品質良好的植物蛋白質資源，但其易變質、難運輸，導致未能進行合理利用，造成優質資源的浪費[1-2]。因此，需進一步研究提高玉米漿的深加工利用的技術。如利用玉米漿生產植物蛋白調味液[3-4]，可以提高玉米漿附加值。

植物蛋白調味液（hydrolyzed vegetable protein，HVP）廣泛應用于配制醬油、餐飲配料、休閑食品調味料等食品領域。目前，主要采用酸水解法、微生物發酵法和酶法生產HVP。酸水解法工藝簡單、操作簡便且產品得率高，是生產HVP中最為普遍的傳統方法，但此法制備的產物含3-氯丙醇類致癌物質[5]，具有一定的食品安全隱患；微生物發酵法主要是通過發酵過程中產生的酶發揮作用，能有效降低生產成本，但微生物單獨作用產生的酶含量低，無法滿足實際生產需求；酶法的效率較高，酶解時間約為2 h～24 h[5-15]，水解反應程度易控制，但成本較高，且易產生苦味物質[5-6]，影響產品風味。

菌酶協同是利用微生物發酵和酶解結合水解原料的工藝，經微生物發酵工藝處理后，添加適量的蛋白酶制劑可以解決微生物產酶不足的問題，微生物在發酵過程中會產味、產香，改善水解液的風味，兩者協同作用水解蛋白質原料，可以增加肽含量，提升水解液的營養價值。同時，從安全性考慮，菌酶協同作用生產的水解液，不會產生3-氯-1，2-丙二醇等有毒致癌物質，提高了食品安全性，且米曲霉種曲和酶制劑綜合使用，降低了原料成本。

本文以玉米漿為原料，選用米曲霉種曲和風味蛋白酶為水解劑，綜合考慮水解液的氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量，確定菌酶協同水解玉米漿制備HVP的適宜工藝，并對其品質指標進行測定，為玉米漿在食品領域的利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

米曲霉種曲：齊齊哈爾大學玉米深加工工程技術研究中心實驗室自制；復配蛋白酶（酶活1.7×105U/g）、酸性蛋白酶（酶活5.0×104U/g）、木瓜蛋白酶（酶活1.1×105U/g）：南寧東恒華道生物科技責任有限公司；復合蛋白酶（酶活 6.9×104U/g）、風味蛋白酶（酶活 1.6×104U/g）、堿性蛋白酶（酶活 7.6×104U/g）：丹麥 Novo公司；玉米漿（干基粗蛋白含量為44.17%）：龍江阜豐生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

全自動氨基酸分析儀（日立L-8900型）：日立Hitachi公司；VELP-杜馬斯定氮儀（NDA701）：北京盈盛恒泰科技有限責任公司；pH計（PB-10）：上海精密科學儀器有限公司；分析天平（FA1104）:上海上平儀器公司；紫外分光光度計（TU-1810）：北京普析通用儀器有限責任公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-30SII）：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；智能磁力攪拌器（ZNCL-GS）：上海凌科實業發展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米曲霉種曲的制備

1.3.1.1 培養基比例

豆粕（g）∶麩皮（g）∶玉米漿（mL）∶水（mL）=3∶7∶1∶8[4]。

1.3.1.2 培養方法

接種量0.3%（質量分數），淺盤（24cm×18cm×2.7cm）培養，厚度約為1.5 cm，培養溫度為30℃～32℃，培養時間為36 h（低溫時48 h）。

1.3.2 米曲霉種曲水解玉米漿制備HVP

1.3.2.1 水解原料

水解原料為玉米漿。

1.3.2.2 預處理

玉米漿混和均勻，50℃水浴30 min，按玉米漿質量加入質量分數 2.1%的中和劑[Ca（OH）2∶NaOH=1∶6，質量比]調節pH值為5.5～6.0，50℃中和反應1 h[先加NaOH 反應 20 min，再加 Ca（OH）2反應 40 min]，得到預處理液。

1.3.2.3 水解

添加質量分數1.86%的米曲霉種曲，溫度50℃，水解3 h，得到米曲霉種曲水解液。

1.3.3 菌酶協同水解玉米漿制備HVP

1.3.3.1 蛋白酶的篩選

前期探究米曲霉種曲水解玉米漿的工藝條件得出，水解的最適pH值為5.5～6.0，固定米曲霉種曲作為第一步水解劑，將第一階段水解液體系的溫度和pH值調至每種蛋白酶的適宜條件，固定加酶量2 000 U/g，在此基礎上繼續研究蛋白酶種類對玉米漿的水解效果。以可溶性蛋白含量和氨基酸態氮含量為指標，篩選出1種適合與米曲霉種曲協同作用水解玉米漿的蛋白酶。不同種類蛋白酶的反應條件如表1所示。

表1 不同種類蛋白酶的反應條件Table 1 Reaction conditions of different proteases

1.3.3.2 菌酶協同水解玉米漿的條件優化

依次優化加酶量、溫度、pH值和水解時間。加酶量為 500、1 000、1 500、2 000、2 500 U/g；溫度為 50、55℃；pH 值梯度為 6.0、6.5、7.0、7.5和 8.0；水解時間為 1、2、3、4、5 h。水解結束后，轉移至沸水浴滅酶 15 min，4 000 r/min離心10 min取上清液進行氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量的測定。

1.3.3.3 正交法優化確定最佳水解條件

根據1.3.3.2的試驗結果，選取pH值（A）、水解時間（B）、加酶量（C）為自變量，氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量為評價指標，建立L9（33）正交試驗，進一步優化菌酶協同水解玉米漿的工藝條件。采用層次分析法確定氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量的權重系數，根據綜合評分進行正交結果的極差與方差分析，確定米曲霉種曲和風味蛋白酶協同水解玉米漿的最佳工藝參數。

1.3.4 粗蛋白含量的測定

取10mL玉米漿于稱量瓶中，70℃條件下烘干10h，烘干后粉碎，稱取樣品30 mg～50 mg于錫箔紙中，包成球形，放入杜馬斯定氮儀，讀數并記錄粗蛋白含量。

1.3.5 可溶性蛋白含量的測定

1.3.5.1 標準曲線的制作

利用Lowry法[16]測定可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白濃度為橫坐標，640 nm吸光度為縱坐標，作標準曲線，如圖1所示，得到線性回歸方程y=0.002 8x+0.020 6，R2=0.996 5。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

1.3.5.2 樣品可溶性蛋白含量的測定

樣品稀釋后取1mL，加入甲液5mL，混勻靜置10 min，再加乙液0.5 mL迅速混勻，30℃水浴保溫30 min，測定640nm吸光度，樣品可溶性蛋白含量計算公式如下。

式中：X為由標準曲線得出的樣品稀釋液的蛋白濃度，μg/mL；N為樣品的稀釋倍數。

1.3.6 氨基酸態氮含量的測定

參考GB/T 18186—2000《釀造醬油》測定氨基酸態氮含量。

取5 mL樣品置于100 mL容量瓶定容，混勻取20 mL，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，開啟磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液（0.05 mol/L）滴定至酸度計指示pH值8.2，加入10mL甲醛溶液（37%～40%），混勻。再用氫氧化鈉標準滴定溶液繼續滴定至pH值9.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液體積。同時取80 mL水，重復滴定步驟做試劑空白試驗，計算公式如下。

式中：X為樣品中氨基酸態氮的含量（以氮計），g/100 mL；V1為樣品稀釋液消耗0.05 mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V2為空白試驗消耗0.05 mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；V3為樣品稀釋液取用量，mL；C為氫氧化鈉標準滴定溶液濃度，mol/L；0.014為1 mL氫氧化鈉標準滴定溶液（濃度為1.0 mol/L）相當于氮的質量，g。

1.3.7 呈味氨基酸含量的測定

采用酸水解法[17]測定，取適量20 mg左右樣品于安瓿管中加入6 mol/L鹽酸，氮吹5 min后封管，于105℃烘箱中水解24 h，測定樣品蛋白中呈味氨基酸含量。

1.4 數據處理

試驗數據采用SPSS軟件、Yaahp軟件處理，采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 米曲霉種曲對玉米漿水解效果的影響

米曲霉是我國食品生產中常用的菌株，具有生長速度快、酶系豐富[18]、適應能力強等特點，利用米曲霉制作種曲，制曲過程中產生豐富的酶系，其中蛋白酶可以將玉米漿中的蛋白質分解為小肽、氨基酸等物質[19]，再結合微生物自身代謝活動，提高玉米漿中有機氮源的利用率，增加水解液的鮮味和香氣。因此，利用米曲霉種曲水解玉米漿是必要步驟。水解液的鮮味和香氣主要來自氨基酸態氮，可溶性蛋白含量越高越易吸收，它們直接影響植物蛋白調味液的品質，因此研究米曲霉種曲對水解產物中氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量的影響，結果見圖2。

由圖2可知，玉米漿經米曲霉種曲水解3h后，相比玉米漿原液，氨基酸態氮含量顯著提高了0.11 g/100 mL（p＜0.05），可溶性蛋白含量提高了 6.0 mg/mL，米曲霉種曲發酵過程中產生蛋白酶，玉米漿中的蛋白質被水解為具有一定空間結構的小分子蛋白，增加了蛋白質的溶解性。

2.2 菌酶協同作用對玉米漿水解效果的影響

2.2.1 蛋白酶的篩選

外加的蛋白酶可以解決微生物產酶不足的問題，兩者協同作用水解玉米漿蛋白，能夠提高反應速率，縮短反應時間，充分分解大分子營養物質，增加肽含量，提升水解液的營養價值。由于不同蛋白酶的切割位點和專一性不同[20-21]，所以不同蛋白酶和米曲霉種曲協同作用的效果也會不同，因此，對蛋白酶的種類進行篩選。根據蛋白酶生產廠家提供的酶反應條件，將體系的溫度和pH值調至各蛋白酶適宜條件，加酶量2 000 U/g，以氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量為指標，比較6種蛋白酶對玉米漿的水解效果，根據試驗結果篩選出1種蛋白酶進行菌酶協同水解玉米漿試驗，試驗結果如圖3。

圖3 蛋白酶種類對米曲霉種曲水解液水解效果的影響Fig.3 Effect of protease species on the hydrolysis of Aspergillus oryzae hydrolysate

由圖3可知，玉米漿經過風味蛋白酶酶解后可溶性蛋白含量和氨基酸態氮含量增加，且風味蛋白酶作用效果高于堿性蛋白酶，風味好，苦味小。經過風味蛋白酶酶解的水解液與米曲霉種曲單獨水解玉米漿相比氨基酸態氮含量增加了0.28 g/100 mL，可溶性蛋白含量增加了17.15 mg/100 mL。風味蛋白酶為中性蛋白酶，綜合考慮選用風味蛋白酶作為后續試驗用酶。

2.2.2 加酶量對玉米漿水解效果的影響

加酶量是影響酶解反應的因素之一，加酶量太少底物分解不充分，加酶量過多則阻礙反應進行[22]，并且成本較高。所以應對蛋白酶添加量進行優化。調節米曲霉水解液pH值7.0，50℃水解3 h，不同的加酶量對水解液氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，米曲霉種曲水解液的氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量與加酶量基本成正比。加酶量超過2 000U/g時，氨基酸態氮含量增加幅度減小，可溶性蛋白含量略微遞減，可能是反應初期底物濃度較高，水解反應快速進行，氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量增加較快；水解反應進行到一定程度后，底物濃度減少，酶和底物結合達到飽和[23]，氨基酸態氮含量增長緩慢。風味蛋白酶添加量2 000 U/g時，米曲霉種曲水解液的氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量與米曲霉種曲水解液相比分別增加0.26 g/100 mL和32.04 mg/mL，水解效果最好，因此，選擇加酶量為2 000 U/g。

2.2.3 溫度對玉米漿水解效果的影響

溫度對發酵和酶反應的影響是多方面的，它會影響各種酶反應的速率，影響微生物的代謝調控機制，進而影響發酵的動力學特性和產物的生物合成。溫度過低，微生物生長代謝緩慢，酶活力下降；溫度越高玉米漿黏度越小，流動性增強反應速度加快，溫度過高導致蛋白質過度變性，微生物失活，影響氨基酸的生成率；適合的溫度可以促進微生物生長代謝和酶促反應的進行。因此，應對水解溫度進行優化。

調節米曲霉水解液pH值7.0、加酶量2 000 U/g和水解3 h，不同的溫度對水解液氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量的影響，結果見圖5。

圖5 溫度對米曲霉種曲水解液水解效果的影響Fig.5 Effect of temperature on the hydrolysis of Aspergillus oryzae hydrolysate

在工廠常用操作溫度基礎上，對溫度條件進行優化，試驗結果表明，55℃條件下水解液的氨基酸態氮含量為1.81 g/100 mL比50℃條件下的1.77 g/100 mL增加0.04 g/100 mL，可溶性蛋白含量增加2.57 mg/mL。溫度上升，玉米漿黏度下降，流動性增強，可以更好地與風味蛋白酶反應，并且在55℃條件下，風味蛋白酶能更好地發揮作用，但由于提高5℃所用的能源和成本遠遠高于水解液氨基酸態氮含量增加0.04 g/100 mL的價值，基于節約能源和成本考慮，選擇50℃為反應溫度。

2.2.4 pH值對玉米漿水解效果的影響

加酶量2 000 U/g，50℃水解3 h，調節米曲霉種曲水解液的pH值，研究pH值對水解液氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量的影響，結果見圖6。

圖6 pH值對米曲霉種曲水解液水解效果的影響Fig.6 Effect of pH on the hydrolysis of Aspergillus oryzae hydrolysate

酶可以將玉米漿中的大分子物質分解成小分子肽和氨基酸，促進蛋白質的吸收和有效利用，增加水解液氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量，同時改善風味。過高或過低的pH值對酶活性和微生物生長繁殖不利，影響微生物對營養的吸收。酶只能在一定限度的pH值范圍內才有活力，酶在最適pH值時活力最強，微生物在最適pH值范圍內生長繁殖最快。因此，優化菌酶協同作用的pH值。由圖6可知，不同pH值條件下，水解液中氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量不同，隨著pH值的增加，氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量整體上呈現先上升后下降趨勢，pH值7.0時氨基酸態氮含量最高為（1.80±0.01）g/100 mL，可溶性蛋白含量為（139.48±5.89）mg/mL。故選擇最適pH7.0。

2.2.5 水解時間對玉米漿水解效果的影響

時間影響水解產物的含量，水解時間過短，玉米漿中的營養物質不能被充分利用，水解時間越長，微生物發酵和酶解作用越充分，但達到一定時間后增長較慢，時間過長，有害物質大量積累，影響水解液質量[4]。為了確定菌酶協同發酵玉米漿制備高含量營養物質的水解時間，在米曲霉種曲水解液pH值7.0，加酶量2 000 U/g，50 ℃條件下，設定水解時間梯度為 1、2、3、4、5 h。

水解時間對水解液氨基酸態氮含量和可溶性蛋白含量的影響，結果見圖7。

圖7 水解時間對米曲霉種曲水解液水解效果的影響Fig.7 Effect of time on the hydrolysis of Aspergillus oryzae hydrolysate

經過菌酶協同作用的水解液可溶性蛋白含量和氨基酸態氮含量均有增加，兩者水解5 h達到最大值，分別為（1.84±0.01）g/100 mL 和（144.19±1.39）mg/mL。氨基酸態氮含量是評價水解液的重要指標，水解3 h時，水解液的氨態氮含量為（1.76±0.02）g/100 mL，時間超過3 h后水解液的氨基酸態氮含量增加幅度減小，水解5 h相比水解3 h增加0.08 g/100 mL，綜合考慮到節約時間和能源，選擇3 h為最適反應時間。

2.2.6 正交分析

在單因素試驗結果基礎上，以可溶性蛋白含量和氨基酸態氮含量為指標，固定溫度，利用正交試驗對pH值、加酶量和水解時間進行參數優化，從而確定最佳水解條件。

2.2.6.1 正交試驗設計

菌酶協同水解玉米漿蛋白工藝優化正交試驗因素水平見表2。

表2 因素水平Table 2 Factors and levels

2.2.6.2 正交試驗結果

菌酶協同水解玉米漿蛋白工藝優化正交試驗結果見表3。

表3 正交試驗設計與結果Table 3 Design and results of orthogonal test

2.2.6.3 指標權重系數的確定

參考文獻[24]中層次分析法法確定權重系數，指標成對比較的判斷優先矩陣見表4。

表4 指標成對比較的判斷優先矩陣Table 4 Judgment priority matrix for comparison of index pairs

2.2.6.4 最佳水解工藝的確定

菌酶協同水解玉米漿蛋白正交試驗直觀分析結果見表5，方差結果分析見表6。

表5 直觀分析結果Table 5 Results of intuitive analysis

表6 方差分析結果Table 6 Results of variance analysis

根據表5評分結果，用Yaahp軟件計算，得到氨基酸態氮含量可溶性蛋白含量的權重系數分別為0.777 8和0.222 2；組合一致性比例因子=0.021 4＜0.10，說明指標成對比較的判斷優先矩陣具有一致性，權重系數有效。由表5、表6可知，各因素對菌酶協同水解玉米漿工藝作用的影響程度為A＞B＞C。方差分析結果表明，pH值對試驗結果的影響顯著（p<0.05）。根據極差分析確定的最佳工藝為A2B3C3，與正交試驗中最優組合一致，說明正交試驗結果可信。依據氨基酸態氮含量分析，A2B3C3工藝組合下達到1.82 g/100 mL，A2B2C1工藝組合下達到1.80 g/100 mL，結合成本因素，選擇A2B2C1為最佳工藝組合，即pH值7.0、水解時間3 h、加酶量1000U/g、溫度50℃。

2.3 植物蛋白調味液的呈味氨基酸組成

天然蛋白質中的氨基酸及其鹽大多具有甜味或苦味，其中天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸這6種氨基酸呈現出特殊鮮味[25]，是植物蛋白調味液風味的重要組成部分。因此，對水解液的呈味氨基酸組成進行分析，結果見表7。

表7 呈味氨基酸組成Table 7 Analysis of flavoring amino acid composition

由表7可知，玉米漿原漿、米曲霉種曲水解液和菌酶協同水解液的呈味氨基酸含量分別為8.02%、8.99%和10.10%，玉米漿蛋白經過順次水解，釋放更多的游離氨基酸，米曲霉種曲水解液和菌酶協同水解液的呈味氨基酸總量在氨基酸總量中的占比分別為48.30%和47.49%，其中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸含量增加量最大，酪氨酸和苯丙氨酸略有增加，它們可能是玉米漿水解物鮮味和甜味的主要來源。

2.4 植物蛋白調味液的衛生指標

食品安全是關乎人體健康的重要問題，食品安全問題多種多樣，其中致病菌會造成食品污染，重金屬危害人體健康，3-氯-1，2-丙二醇等產物會引發癌癥。所以基于食品安全角度出發，按照我國農業行業規定的綠色食品標準NY/T1886—2010《綠色食品復合調味料》對植物蛋白調味液進行檢測，衛生指標檢測結果見表8。

表8 樣品衛生指標Table 8 Hygiene indicators of samples

由表8可知，菌酶協同水解玉米漿制備的植物蛋白調味液中未檢出3-氯-1，2-丙二醇、多氯聯苯、黃曲霉毒素等致癌物質，不含有沙門氏菌等病原微生物，衛生指標符合食品安全標準，無毒、無害。

3 結論

本文以粗蛋白含量為44.17%的玉米漿為研究對象，采用單因素法和正交試驗對菌酶協同水解玉米漿制備水解液的工藝進行優化，綜合經濟成本，得到最合適的工藝參數為pH值 7.0、水解時間3 h、加酶量1 000 U/g和溫度50℃。在此條件下，可溶性蛋白為（138.57±1.28）mg/mL，氨基酸態氮含量為（1.80±0.01）g/100 mL，菌酶協同水解工藝能夠顯著提高玉米漿的營養價值。植物蛋白調味液呈味氨基酸含量占氨基酸總量的47.49%，風味良好，符合食品安全標準，為充分利用玉米漿蛋白提供新思路。