基于糖蜜原料的γ-聚谷氨酸發酵培養基優化

李祥松，王慧超，趙廷彬，張琳，孫銀華，李振海，徐雪天，喬長晟，，，4*，鄭保國

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津慧智百川生物工程有限公司，天津 300457；3.天津北洋百川生物技術有限公司，天津 300457；4.天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457，5.寧夏農林科學院農業生物技術研究中心，寧夏 銀川 750002）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA） 是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過γ-羧基和α-氨基之間的酰胺鍵連接的水溶性高分子材料[1-2]。由于其對環境無污染，具有優良的生物降解性、成膜性、纖維性、保水性等特殊的理化性能，被廣泛應用于醫藥、農業、環保、化妝品、食品等行業[3-7]。Ivánovics等[8]在炭疽芽孢桿菌中第一次發現γ-PGA，是其芽孢桿菌莢膜的主要成分；之后Bovarnick[9]從枯草芽孢桿菌的發酵液中發現了γ-PGA。微生物發酵制備γ-PGA主要使用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等芽孢桿菌屬。

目前微生物發酵存在產量不高，菌株性能不穩定，生產成本高，難以工業化生產等問題，篩選高產菌株、優化發酵培養基與培養條件是提高γ-PGA產量的幾個主要手段。目前，γ-PGA生產菌株多為谷氨酸依賴型，常用碳源有葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油等。張雷等[10]利用響應面法優化，發現使用葡萄糖作為碳源發酵γ-PGA產量最高，達到28.1 g/L；盛潔等[11]以蔗糖為碳源利用響應面法優化得到的γ-PGA產量為41.2 g/L。糖蜜中以蔗糖為主[12]，因此糖蜜可以作為碳源被應用到微生物發酵中，姚麗萍等[13]研究了糖蜜為碳源發酵L-絲氨酸，最終L-絲氨酸產量為32.76 g/L，相較于蔗糖發酵產量提高了29.44%；徐海東等[14]使用糖蜜發酵乙醇，發酵結束乙醇濃度達到100.99 g/L。孔凡利等[15]使用菠蘿皮渣與甘蔗糖蜜復合發酵釀制果醋，醋香味明顯；劉紅陽[16]利用枯草芽孢桿菌yt102以糖蜜為碳源發酵農用γ-PGA，產量可達32.7 g/L。

本研究為了提高γ-PGA產量，降低生產成本，以甘蔗糖蜜為碳源，對培養基組分進行響應面優化，采用單因素試驗篩除培養基中對γ-PGA產量起抑制或無影響的組分，確定顯著因子中心點，Box-Behnke設計[17]構建相應方程并預測得到最優培養基配方，為γ-PGA的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.23967：天津北洋百川生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨（生化試劑）、酵母浸膏（生化試劑）、瓊脂粉（分析純）、葡萄糖（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、K2SO4、CaSO4·2H2O、FeSO4·7H2O、甘 油（均為分析純）：維科特天津化工產品貿易有限公司；酵母膏（Ⅰ型～Ⅶ型）：北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨（Ⅰ型～Ⅵ型）：安琪酵母股份有限公司；味精（99%）：梅花生物科技集團股份有限公司；甘蔗糖蜜：市售；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設備

752紫外分光光度計：天津市光學儀器廠；SBA-40E生物傳感儀：山東省科學院生物研究所；LC-20AT高效液相色譜分析儀：日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基配制

LB固體培養基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，瓊脂2%。調節初始pH7.2～pH7.3，121℃滅菌20 min。

種子培養基：葡萄糖30 g/L、酵母膏7 g/L、K2HPO4·3H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始 pH（7.2±0.1），121 ℃滅菌 20 min。

初始發酵培養基：味精濃度70 g/L、糖蜜可溶性固形物 9%、酵母膏 10 g/L、蛋白胨 5 g/L、（NH4）2SO47 g/L、K2SO415 g/L、CaSO4·2H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g/L、甘油 60 mL/L，初始 pH（7.2±0.1），121℃滅菌20 min。

1.3.2 菌種培養方法

種子活化：在無菌操作臺用接種環從甘油管中蘸取2環～3環菌液，劃線于裝有LB固體培養基的培養皿中，放置在37℃恒溫培養箱中培養16 h。然后將培養皿中的菌種挑起，并均勻涂抹于斜面培養基上，37℃恒溫培養12 h。

種子培養：接種前將滅菌后的葡萄糖溶液轉入裝有種子培養基的三角瓶中，然后使用接種環將活化好的菌種斜面接種于裝有100 mL種子培養基的500 mL無擋板三角瓶中，置于轉速為220 r/min的37℃恒溫搖床中培養14 h～16 h。

發酵培養：將種子液以10%接種量接入含有5 mL發酵培養基的500 mL擋板三角瓶中，置于轉速為220 r/min的37℃恒溫搖床中培養72 h。

1.3.3 γ-PGA標準曲線制作

準確稱取γ-PGA標準品0.100 0 g，于80 mL純凈水中溶解后定容至100 mL，配制成濃度為1 g/L的母液，取適量母液逐級稀釋，配制 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的濃度梯度的標準液。以0.22 μm水相濾膜過濾上述5個梯度濃度的γ-聚谷氨酸標準液并裝入2.5 mL的液相小瓶中，將樣品放入高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀，利用紫外檢測器檢測，建立峰面積和標準品濃度的標準曲線。

HPLC的檢測條件：紫外檢測器、波長210 nm、凝膠滲透色譜柱、流動相0.05 mol/L無水Na2SO4溶液、流速 0.5 mL/min、停止時間 35 min、進樣量 20 μL、檢測器溫度35℃、柱溫30℃。

1.3.4 樣品γ-PGA濃度測定

取發酵液15000r/min離心15min，取1mL上清液到100 mL容量瓶用流動相定容至100 mL，以0.22 μm水相濾膜過濾上述稀釋后的樣品并裝入2.5 mL的液相小瓶中，放入HPLC儀，利用紫外檢測器檢測，利用標準曲線計算出樣品濃度。

1.3.5 可溶性固形物含量測定

將樣品滴到手持糖度計檢測棱鏡上，合上蓋板，避免氣泡產生，使溶液遍布棱鏡表面；將手持糖度計的進光板對準光源或明亮處，眼睛通過目鏡觀察視場，藍黃分界線的刻度值即為樣品溶液的可溶性固形物含量。

1.3.6 工藝優化試驗說明

1.3.6.1 單因素試驗設計

探索培養基中甘油濃度（0、20、40、60、80 mL/L）、糖蜜可溶性固形物濃度（5%、7%、9%、11%、13%）、不同酵母膏種類、酵母膏濃度（1、4、7、10、13、16 g/L）、不同蛋白胨種類、（NH4）2SO4濃度（0、2、4、6、8、10 g/L）、K2SO4濃度（0、3、6、9、12、15 g/L）、CaSO4·2H2O 濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）、MgSO4·7H2O 濃 度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）、FeSO4·7H2O 濃度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L）、味精濃度（0、20、40、60、80、100 g/L） 對地衣芽孢桿菌 （Bacillus licheniformis）CGMCC NO.23967產γ-聚谷氨酸的影響。

1.3.6.2 響應面優化試驗設計

采用三因素三水平響應面試驗研究主要影響因子對地衣芽孢桿菌CGMCC NO.23967產γ-PGA的影響，通過單因素試驗確定糖蜜可溶性固形物濃度、酵母膏濃度、FeSO4·7H2O濃度作為因變量，γ-PGA產量為響應值。試驗因素與水平編碼如表1所示。

表1 響應面設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 數據處理

采用Design-expert 8.0.6軟件進行響應面試驗數據處理，采用Origin 2018作圖，Excel進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 培養基成分單因素試驗

碳氮源對γ-PGA產量的影響如圖1所示。

圖1 碳氮源對γ-PGA產量的影響Fig.1 Effect of the carbon and nitrogen source on the yield of γ-PGA

由圖1A可知，當甘油濃度為0～40 mL/L時，γ-PGA產量差異不明顯，當甘油濃度在高于40 mL/L時，γ-PGA產量明顯下降，由此可見，當甘油濃度低時，對該菌株的γ-PGA產量影響不大，當甘油濃度較高時抑制該菌株產γ-PGA，因此后續試驗發酵培養基中不再添加甘油。甘油在初始發酵培養基中成本占比相對較高，因此當發酵培養基中去除甘油后，發酵成本顯著降低。由圖1B可知，γ-PGA產量在糖蜜可溶性固形物濃度為5%～9%時，隨著糖蜜可溶性固形物濃度增加而增加，在糖蜜可溶性固形物濃度為9%時達到最大，最大產量為（36.02±0.76）g/L，當糖蜜可溶性固形物濃度為9%～13%時，隨著糖蜜可溶性固形物濃度的增加，γ-PGA產量下降。因此，選擇糖蜜可溶性固形物添加量9%為最佳添加量。由圖1C可知，使用Ⅲ型酵母膏γ-PGA的產量明顯高與其他種類的酵母膏，產量最高。可以看出不同型號的酵母膏對γ-PGA產量影響顯著，可能不同種類型號所含成分有差異，因此，選擇Ⅲ型酵母膏作為最佳酵母膏，后續試驗使用Ⅲ型酵母膏。由圖1D可以看出，當酵母膏濃度為4 g/L時γ-PGA產量最高，低于4 g/L時隨著酵母膏濃度的增加，γ-PGA產量增加，當酵母膏濃度高于4 g/L時，γ-PGA產量隨酵母膏濃度的增加而減少，因此選擇4 g/L為酵母膏最佳濃度。由圖1E可知，在不添加蛋白胨的情況下，酵母膏與糖蜜所提供的有機氮源已經可以滿足菌體自身生長需求，不需要額外再添加有機氮源，因此，后續試驗不再添加蛋白胨，進一步降低了成本。

金屬元素與味精對γ-PGA產量的影響如圖2所示。

圖2 金屬元素與味精對γ-PGA產量的影響Fig.2 Effect of metallic element and monosodium glutamate on the yield of γ-PGA

由圖2A可知，隨著K2SO4濃度的提高，γ-PGA產量降低，鉀離子在微生物體內直接參與物質運輸，但在本試驗中鉀離子的添加出現抑制現象，推測糖蜜中可能含有足夠的鉀離子（4.45%）滿足菌體生長需求。因此，將K2SO4從培養基中除去，后續試驗不再添加，發酵培養基成本進一步降低。由圖2B可知，（NH4）2SO4的添加并不會對γ-PGA的產量有促進作用，相反，當（NH4）2SO4濃度高于8 g/L時，對γ-PGA有明顯抑制作用，因此，后續試驗不再添加（NH4）2SO4。由圖2C、2D可知，CaSO4·2H2O與MgSO4·7H2O濃度對γ-PGA產量均無顯著影響。由圖2E可知，FeSO4·7H2O的濃度對γ-PGA產量影響較大，當FeSO4·7H2O濃度在0～0.7 g/L時，隨著FeSO4·7H2O濃度增加，γ-PGA產量明顯增加，并在FeSO4·7H2O濃度為0.7 g/L時達到最高；當FeSO4·7H2O濃度高于0.7 g/L時，γ-PGA產量變化不明顯。因此，選擇0.7 g/L為FeSO4·7H2O的最佳添加濃度。γ-PGA生產菌株按是否需要大量外源添加谷氨酸單體分為谷氨酸依賴型與非谷氨酸依賴型[18]。味精作為γ-PGA的前體物質，味精的濃度對γ-PGA產量比較明顯，由圖2F可知，當味精濃度在0～80 g/L時，γ-PGA產量顯著增加，當味精濃度高于80 g/L時，γ-PGA產量不再增加。因此選擇80 g/L為味精最佳添加濃度。

2.2 響應面設計試驗結果

選取糖蜜可溶性固形物濃度（A）、酵母膏濃度（B）、FeSO4·7H2O 濃度（C）為試驗因素，γ-PGA 產量（Y）為響應值進行響應面試驗，并對結果進行方法分析，響應面試驗設計與結果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface results

使用Design Expert軟件對響應面試驗結果進行分析，得到以γ-PGA產量為因變量，A、B、C為自變量的二次多項式回歸方程：γ-PGA產量Y=66.46-1.19A+1.08B+2.67C+0.33AB-1.22AC+0.43BC-5.22A2-5.39B2-3.47C2。線性模型自變量系數的正系數表示促進作用，負系數表示抑制作用[19]，B、C系數為正表示在研究范圍內有利于提高γ-PGA的產量，A則相反。當回歸系數和各獨立因素之間的交互作用P值低于0.05時，在統計學上認為是差異顯著的[20]，由表3可知，本試驗的P＜0.000 1，說明回歸方程的顯著性為差異極顯著。失擬項P值為0.077＞0.05，說明失擬項不顯著。從表中可以看出，C、A2、B2和 C2對 γ-PGA 產量影響極顯著（P＜0.01），A、B 與 AC 差異顯著（P＜0.05），交互項 AB、BC差異不顯著（P＞0.05）。另外，該模型決定系數為R2=0.983 9，R2Adj=0.963 1，均大于0.95，說明擬合程度較好，預測值與實際值具有高度的相關性，可以應用于地衣芽孢桿菌CGMCC NO.23967菌株發酵γ-PGA的理論預測。

響應面設計的曲面圖可以清晰地展示出兩種變量之間的交互作用，以及各變量對γ-PGA產量的影響[21]，本研究利用響應面法揭示了糖蜜可溶性固形物濃度、酵母膏濃度與FeSO4·7H2O濃度對γ-PGA產量的影響，控制其中一個因素不變，另外兩個因素交互作用而呈現出來的三維曲面圖與等高線圖如圖3～圖5所示。

圖3 糖蜜可溶性固形物濃度與酵母膏濃度交互作用對γ-PGA產量的影響Fig.3 Effect of interaction between soluble solid concentration of molasses and yeast extract concentration on the yield of γ-PGA

圖4 糖蜜可溶性固形物濃度與FeSO4·7H2O濃度交互作用對γ-PGA產量的影響Fig.4 Effect of interaction between soluble solids concentration of molasses and FeSO4·7H2O concentration on the yield of γ-PGA

圖5 酵母膏濃度與FeSO·47H2O濃度交互作用對γ-PGA產量的影響Fig.5 Effects of interaction between yeast extract concentration and FeSO·47H2O concentration on the yield of γ-PGA

從三維曲面圖可以看出隨著各因素的用量增加，γ-PGA產量也隨之增加，到達最高點后，隨著各因素用量繼續增加，γ-PGA產量開始呈現下降趨勢。響應面彎曲度越大說明兩個因素的交互作用越明顯，與圖4相比圖3與圖5彎曲程度最高，三者的響應面彎曲程度順序為糖蜜可溶性固形物濃度與FeSO4·7H2O濃度的交互作用＞酵母膏濃度與FeSO4·7H2O濃度的交互作用＞糖蜜可溶性固形物濃度與酵母膏濃度的交互作用。

響應面的等高線圖可以反映出兩個因素交互作用對響應值的影響，如果等高線形狀為橢圓形，則兩個因素交互作用顯著；等高線越接近圓形，則兩個因素交互作用越不顯著[22]。圖3與圖5中等高線圖接近圓形，表明糖蜜可溶性固形物濃度與酵母膏濃度、酵母膏濃度與FeSO4·7H2O濃度的交互作用對γ-PGA產量影響不顯著，圖4等高線圖近似橢圓形，表明糖蜜可溶性固形物濃度與FeSO4·7H2O濃度的交互作用對γ-PGA產量影響顯著。圖3酵母膏濃度與糖蜜可溶性固形物濃度交互作用的等高線在糖蜜可溶性固形物濃度一側排列更為緊密，說明糖蜜可溶性固形物濃度對γ-PGA產量的影響比酵母膏濃度更大；圖5酵母膏濃度與FeSO4·7H2O濃度交互作用的等高線排列緊密程度差距不明顯；而圖4糖蜜可溶性固形物濃度與FeSO4·7H2O濃度交互作用的等高線在糖蜜可溶性固形物濃度一側排列更緊密，說明糖蜜可溶性固形物濃度相比于FeSO4·7H2O濃度對γ-PGA產量影響更大。

2.3 響應面優化試驗預測結果驗證

回歸方程表明當糖蜜可溶性固形物濃度為8.68%、酵母膏濃度4.23 g/L、FeSO4·7H2O濃度為0.78 g/L，味精濃度為80 g/L時，γ-PGA產量預測值最高達67.17 g/L。為了驗證響應面分析的準確性，通過模擬出的最佳培養基參數進行6次重復發酵驗證，得到γ-PGA產量平均值為（67.88±0.41）g/L。試驗值與預測值相差0.71 g/L，有99%的概率接近實際值，說明響應面試驗模型可靠，為后續發酵罐放大試驗與工業化生產奠定了基礎。

3 結論

以甘蔗糖蜜為碳源發酵γ-PGA，用單因素試驗篩選出初始培養基中，對γ-PGA產量有消極作用或無顯著影響的因素以提高產量及降低成本，應用響應面法確定了糖蜜可溶性固形物、酵母膏與FeSO4·7H2O濃度。結果顯示，最佳培養基為糖蜜可溶性固形物濃度8.68%、酵母膏濃度4.23 g/L、FeSO4·7H2O濃度0.78 g/L，味精濃度80 g/L，在此條件下γ-PGA產量為（67.88±0.41）g/L，相較于優化前（31 g/L）優化后γ-PGA產量提高了1.19倍。為后續放大試驗與工業化生產奠定基礎，為糖蜜發酵γ-PGA提供方案。