乳腺癌組織中ZEB2、E-Cad表達與患者預后的關系

王曉燁， 冬國友， 劉志英

（1.唐山市婦幼保健院病理科，河北 唐山 063000；2. 唐山市婦幼保健院普外科，河北 唐山 063000）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一。轉移和復發是導致乳腺癌患者不良預后的主要原因[1]。 尋找乳腺癌的特異性生物標志物，建立有效監控癌細胞侵襲和轉移的方法，及時干預，對于延長患者生存時間、改善預后具有重大意義。有研究結果顯示，雌激素受體（estrogen receptor，ER）、人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、孕激素受體（progestrone receptor，PR）等細胞因子在乳腺癌中呈異常表達，與乳腺癌的發生、發展及患者預后密切相關[2]。另外，上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在乳腺細胞的惡性演變中發揮了主要作用[3]。抑制乳腺癌細胞的EMT過程能明顯減弱其轉移和侵襲能力[4]。上皮型鈣黏蛋白（epithelial-cadherin，E-Cad）和E盒結合鋅指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2，ZEB2）等參與了EMT的調控過程。本研究擬探討ZEB2和E-Cad在乳腺癌轉移、侵襲和預后評估中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2010年7月—2014年7月唐山市婦幼保健院接受乳腺癌根治術的患者80例，年齡32～68歲。收集所有患者術中切除的癌組織及對應的癌旁組織（距癌組織≤3 cm）樣本，同時收集其臨床病歷資料。通過定期電話、門診復查等形式進行隨訪，隨訪時間從手術結束開始至2019年8月或死亡為止。本研究經唐山市婦幼保健院倫理委員會批準。

納入標準：（1）均經影像學、病理學檢查確診為原發性乳腺癌，病歷資料完整；（2）均經手術治療，術前未經放療、化療及其他免疫方法治療；（3）患者或其家屬簽署知情同意書。

排除標準：（1）合并其他部位的惡性腫瘤；（2）有腺瘤性息肉病家族史；（3）有嚴重的肝、腎功能障礙或其他并發癥；（4）有其他遺傳性乳腺癌綜合征；（5）有免疫功能障礙或其他代謝障礙性疾病；（6）有血液系統疾病。

1.2 儀器和試劑

兔抗人ZEB2、E-Cad、ER、HER-2和PR單克隆抗體購自美國Abcam公司。免疫組化試劑盒購自南京建成生物有限公司。磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）購自美國Santa Cruz公司，組織裂解液購自美國Millipore公司，Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。BX51T-12P01生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司），T100 PCR儀（美國伯樂公司）。

1.3 ZEB2、E-Cad、ER、HER-2和PR蛋白表達檢測

將兔抗人ZEB2、E-Cad、ER、HER-2和PR單克隆抗體進行1∶500稀釋，嚴格按免疫組化試劑盒說明書進行病理切片及染色，在BX51T-12P01生物顯微鏡下觀察，并記錄結果。

1.4 陽性判定標準

免疫組化評分標準[5]：根據染色細胞密度進行評分，陽性細胞比例＜25%為0分，25%～ ＜50%為1分，50%～＜75%為2分，75%～100%為3分；根據組織染色程度進行評分，無色為0分，淡黃色為1分，黃褐色為2分，棕褐色為3分。免疫組化評分為兩者評分的乘積。0～3分為蛋白表達陰性，4～9分為蛋白表達陽性。

1.5 癌組織和癌旁組織ZEB2、E-Cad mRNA表達的檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測癌組織和癌旁組織ZEB2 mRNA、E-Cad mRNA的表達。取適量乳腺組織和癌旁組織樣本，研碎、裂解后按Trizol試劑盒要求提取總RNA[6]。將RNA逆轉錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA）。采用SYBR Green熒光定量試劑盒和T100 PCR儀檢測目的基因的表達。引物由北京力高泰科技有限公司合成。ZEB2 mRNA上游引物為5'-CTCCCAGGTCTGGTGTGTTG-3'，下游引物為5'-GAGGTCTAGGTAGGAGGTGAAG-3'；E-Cad mRNA：上游引物為5'-ACTGTCCGAAT- TGACATCATGG-3'，下游引物為5'-TTCTGAG- CTTCCACCAAAACTC-3'；內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物為5'-GGAG- CGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物為5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.6 癌組織和癌旁組織ZEB2、E-Cad蛋白表達的檢測

采用免疫印跡法檢測癌組織和癌旁組織ZEB2、E-Cad蛋白的表達。取癌組織和癌旁組織樣本，加入組織裂解液，提取總蛋白，測定蛋白濃度，置于沸水中變性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉至聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉清洗3次后，在封閉液中孵育30 min，加入一抗（ZEB2、E-Cad，1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜，加入二抗，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，以GAPDH作為內參，采用Image J圖像分析軟件（美國國立衛生研究院）分析各條帶的灰度值。

1.7 乳腺癌分子分型方法

參照相關國際共識[7]中的標準，根據免疫組化結果進行乳腺癌分子分型：ER陽性、PR陽性表達≥20%、HER-2陰性定義為Luminal A型；ER或PR陽性、HER-2陽性定義為Luminal B型；ER和PR陰性、HER-2陽性定義為HER-2過表達型；ER、PR和HER-2均陰性定義為基底樣型。

1.8 統計學方法

使用SPSS 20.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以x±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman相關分析評估乳腺癌組織ZEB2與E-Cad的相關性。采用Kaplan-Meier生存曲線分析ZEB2、E-Cad表達與乳腺癌患者生存率之間的關系。采用Cox比例風險模型分析乳腺癌患者5年生存率的影響因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析ZEB2和E-Cad判斷乳腺癌預后的效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織ZEB2、E-Cad陽性表達的比較

免疫組化結果顯示，癌組織ZEB2呈陽性表達，E-Cad呈陰性表達；癌旁組織ZEB2呈陰性表達，E-Cad呈強陽性表達。癌組織ZEB2陽性率顯著高于癌旁組織（P＜0.001），E-Cad陽性率顯著低于癌旁組織（P＜0.001）。見圖1、表1。 Spearman相關分析結果顯示，乳腺癌組織ZEB2表達與E-Cad表達呈負相關（r=-0.265，P=0.018）。

圖1 癌組織和癌旁組織ZEB2、E-Cad蛋白表達的免疫組化結果（×400）

2.2 癌組織與癌旁組織ZEB2 mRNA、E-Cad mRNA相對表達量的比較

癌組織ZEB2 mRNA相對表達量顯著高于癌旁組織（P＜0.05），E-Cad mRNA相對表達量顯著低于癌旁組織（P＜0.05）。見圖2。

2.3 不同臨床病理參數乳腺癌患者之間ZEB2、E-Cad陽性表達的比較

ZEB2表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移、TNM分期、HER-2表達均有關（P＜0.05），與年齡、遠隔轉移、ER表達、PR表達、分子分型、病理類型、組織學分級均無關（P＞0.05）。E-Cad表達與淋巴結轉移、TNM分期、ER表達、PR表達、HER-2表達均有關（P＜0.05），與年齡、腫瘤直徑、遠隔轉移、病理類型均無關（P＞0.05）。見表2。

表1 癌組織與癌旁組織ZEB2、E-Cad陽性表達的比較

圖2 癌組織與癌旁組織ZEB2 mRNA、E-Cad mRNA相對表達量的比較

表2 不同臨床病理參數的乳腺癌患者之間ZEB2、E-Cad陽性表達的比較

2.4 ZEB2、E-Cad表達與乳腺癌患者總生存率的Kaplan-Meier生存曲線分析

隨訪結果顯示，8 0例乳腺癌患者死亡21例，5年總生存率為73.75%（59/80）。癌組織ZEB2陰性乳腺癌患者的5年總生存率為83.33%，顯著高于ZEB2陽性患者（72.06%）（P＜0.05）。癌組織E-Cad陽性乳腺癌患者的5年總生存率為80.00%，高于陰性表達患者（72.86%）（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 ZEB2陰性和陽性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

圖4 E-Cad陰性和陽性乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.5 影響乳腺癌患者預后的因素

以腫瘤直徑（＜1.5 cm為0，≥1.5 cm為1）、淋巴結轉移（有=1，沒有=0）、TNM分期（Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、ZEB2表達（陽性=1，陰性=0）、E-Cad表達（陽性=1，陰性=0）、ER表達（陽性=1，陰性=0）、HER-2表達（陽性=1，陰性=0）、PR表達（陽性=1，陰性=0）作為自變量，以患者的5年生存率為因變量，進行Cox比例風險模型分析。結果顯示，淋巴結轉移、TNM分期、ZEB2表達、E-Cad表達是影響乳腺癌患者預后的因素[風險比（hazard ratio，HR）分別為3.47、6.49、2.35、0.15，95%可信區間（confidence interval，CI）分別為2.48～5.67、1.17～8.67、2.00～5.64、0.08～0.78]。見表3。

表3 乳腺癌患者預后影響因素分析

2.6 ZEB2、E-Cad單項檢測和聯合檢測判斷乳腺癌患者預后的效能

ROC曲線分析結果顯示，ZEB2、E-Cad單項檢測和聯合檢測判斷乳腺癌患者5年生存的曲線下面積分別為0.618、0.638、0.827，敏感性分別為73.5%、72.9%、84.5%，特異性分別為77.8%、76.9%、83.7%。見圖5。

圖5 ZEB2、E-Cad單項和聯合檢測判斷乳腺癌患者5年生存的ROC曲線

3 討論

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一。尋找能反映乳腺癌病變及術后效果的分子標志物，進行個體化診斷和預后預警是目前乳腺癌診療領域的研究熱點。EMT是腫瘤細胞轉移和侵襲的重要過程[8]。有研究結果顯示，EMT廣泛參與了腫瘤細胞增殖、免疫逃逸和腫瘤血管新生等生物學行為，是腫瘤細胞侵襲和遷移的關鍵[9]。

穿膜糖蛋白E-Cad主要介導細胞間質之間的特異性連接，是腫瘤細胞EMT中的關鍵因子，對維持上皮細胞的正常極性、完整性以及抑制細胞逃逸有重要作用[10]。E-Cad表達降低是EMT啟動的標志。有研究結果顯示，E-Cad蛋白表達異常造成的E-Cad功能障礙與多種腫瘤（鼻咽癌、非小細胞肺癌、宮頸癌等）患者的不良預后和生存率降低密切相關[11]。本研究結果顯示，乳腺癌組織E-Cad mRNA及蛋白的表達均低于癌旁組織（P＜0.05）；E-Cad表達與淋巴結轉移、TNM分期、ER表達、PR表達、HER-2表達、分子分型、組織學分級有關；Cox比例風險模型分析結果顯示，E-Cad表達是乳腺癌患者預后的影響因素。提示E-Cad表達與乳腺癌細胞的轉移和侵襲有關。

胞核轉錄因子ZEB2是E盒結合鋅指蛋白家族成員之一。ZEB2介導了腫瘤細胞的EMT過程，可通過調控EMT來實現腫瘤細胞的浸潤和轉 移[12]。XAVIER等[13]的研究結果顯示，ZEB2的高表達可直接提高犬乳腺癌細胞的轉移和侵襲能力。ZHOU等[14]的研究結果顯示，ZEB2可調控胃癌細胞中轉化生長因子β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）的轉錄，促進EMT。羅慶豐等[15]的研究結果顯示，ZEB2可與鼻咽癌細胞胞核內E-基因的啟動子特異性結合，抑制E-Cad蛋白的轉錄，推動EMT的進程，從而增強鼻咽癌細胞的侵襲和轉移能力。本研究結果顯示，乳腺癌組織ZEB2 mRNA及蛋白表達均高于癌旁組織（P＜0.05）；ZEB2表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移、TNM分期、HER-2表達有關（P＜0.05）；Cox比例風險模型分析結果顯示，ZEB2表達是乳腺癌患者預后的影響因素；Spearman相關分析結果顯示，在乳腺癌組織中，ZEB2表達與E-Cad表達呈負相關（r=-0.265，P=0.018）。提示ZEB2可能參與了乳腺癌細胞的轉移和侵襲。此外，本研究ROC曲線分析結果顯示，ZEB2、E-Cad單項和聯合檢測判斷乳腺癌患者5年生存的曲線下面積分別為0.618、0.638、0.827，敏感性分別為73.5%、72.9%、84.5%，特異性分別為77.8%、76.9%、83.7%。

綜上所述，乳腺癌組織ZEB2和E-Cad表達異常，與乳腺癌細胞生物學行為及患者5年生存率密切相關，或可用于評估乳腺癌預后潛在指標。