精液優化處理后正常形態精子百分率對體外受精 胚胎結局的影響

李 赟， 尹 萍， 張武文， 李 凱， 童國慶

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院生殖醫學中心，上海 201203）

近年來，全球借助輔助生殖技術助孕的患者持續增多[1]。體外受精（in vitro fertilization，IVF）是目前治療不孕癥的主要方法。精子形態是精液參數的重要指標之一，其對胚胎發育的影響尚有不確定性[2-3]。本研究篩選了上海中醫藥大學附屬曙光醫院生殖醫學中心因女方輸卵管因素行IVF的患者，收集取卵當日優化處理后的精液，通過分析正常形態精子百分率對胚胎發育的影響，探索可以改善IVF臨床治療結局的理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2019年6月—2020年12月上海中醫藥大學附屬曙光醫院生殖醫學中心行IVF的患者255例。入組標準：（1）單純因輸卵管因素導致不孕；（2）女方年齡≤35歲；（3）術前體檢中未發現異常指標；（4）獲卵數≥3個；（5）男方年齡≤45歲；（6）男科門診生育力檢查未發現器質性疾病。取卵當日對經優化處理的精液進行精子形態學分析，正常形態精子百分率均高于臨床正常值（≥4%），符合最佳IVF授精要求。以正常形態精子百分率均值為分界點分為A組（正常形態精子百分率≤19.03%，128例）和B組（正常形態精子百分率＞19.03%，127例）。本研究納入標本的正常形態精子百分率情況見表1。

表1 正常形態精子百分率

1.2 精液樣本采集

男方禁欲2～7 d，采集精液前排尿，并用肥皂清潔以減少標本污染，使用手淫法在專用取精室收集精液標本，置于37 ℃培養箱中溫育30 min后觀察1次，然后10 min觀察1次，總時長不超過1 h，待完全液化后行精液優化 處理。

1.3 精液優化處理

采用密度梯度離心法進行精液優化處理：在15 mL的專用離心管中加入1～2 mL 80%濃度的梯度液，在其上方緩慢地加入相應體積的40%濃度梯度液，沿管壁加入2～4 mL精液，使其形成明顯分界線后，300×g離心20 min，棄上清液，用相同體積培養液混勻、沉淀；取5 μL優化處理的精液，加入10 μm厚Marker精子計數板（以色列Sefi Medical Instruments公司）腔室，計算精子密度，并將其調整至前向運動精子總數＞10×106/mL；留取適量精液推片，用于精子形態分析；其余精液待后續IVF加精使用。

1.4 精子形態分析

采用新型改良巴氏染色法（珠海貝索生物技術有限公司）對精液涂片進行染色分析。（1）將精液涂片放入95%乙醇固定不少于 15 min；（2）依次浸入80%、50%乙醇各30 s后緩水洗干凈；（3）放入蘇木精染液染色3～ 5 min后，水洗12 min；（4）酸性乙醇（70%乙醇200 mL加入1 mL濃鹽酸）溶液浸1～4次；（5）緩水沖洗回藍，平衡5 min后，依次放置于50%、80%乙醇30 s，再用6.95%乙醇脫水 2 min；（6）浸入改良巴氏染色液2～5 min，瀝凈；（7）用95%乙醇洗2次，每次10～20 s；（8）用無水乙醇脫水30 s，取出，待風干后行顯微鏡鏡檢。讀片人員為2位取得世界衛生組織人類精液與處理實驗手冊培訓證書者。評判標準參照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》[4]中的精子形態學標準，在油鏡下分析精子頭部的頂體、細胞核、頸部和中段、主段的形態；每次連續計數完全鏡下視野精子數不少于200條；2次計數核準需符合95%可信區間范圍，計算每份標本2次計數的均值。

1.5 IVF

采用3037受精皿進行IVF，每個3037受精皿中加入卵母細胞≤15個。加精后，將培養皿放置于37 ℃、6%CO2培養箱中培養。受精 1 6～1 8 h后觀察受精情況。以卵細胞原核（pronucleus，PN）≥1為受精，記錄受精情況，其中2PN為正常受精。取卵72 h后再次觀察，記錄胚胎細胞數和細胞內的碎片情況。按胚胎實驗室標準操作規程（standard operation procedure，SOP）觀察胚胎等級，執行標準分為4個等級：（1）Ⅰ級為卵裂球大小均勻，形態規則，透明帶完整，細胞質均勻、清晰，無顆粒，碎片率為0%～5%；（2）Ⅱ級為卵裂球大小略不均勻，形態較不規則，細胞質內有顆粒，碎片率為6%～20%；（3）Ⅲ級為卵裂球大小明顯不均勻，有明顯的形態不規則，細胞質內有較多顆粒，碎片率為21%～50%；（4）Ⅳ級為卵裂球大小嚴重不均勻，細胞質內有非常多的顆粒，碎片率＞50%。6個細胞，Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優質胚胎；≥6個細胞，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級胚胎為有效胚胎。

1.6 主要觀察指標

主要觀察指標包括受精率（受精數/取卵數×100%）、異常受精率（異常受精數/受精數× 100%）、卵裂率（卵裂數/受精數×100%）、優質胚胎率（優質胚胎數/有效胚胎數×100%）、有效胚胎率（有效胚胎數/卵裂數×100%）。

1.7 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，非正態分布的計量資料以中位數（M）[四分位數P25～P75）]表示，組間比較采用Z檢驗。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A組與B組基本資料比較

A組與B組基本資料差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 2個組胚胎相關指標比較

B組有效胚胎率顯著高于A組（P=0.038）；受精率、卵裂率、異常受精率和優質胚胎率2個組差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表2 A組與B組基本資料比較

表3 精液優化處理后正常形態精子百分率與胚胎相關參數的關系

3 討論

隨著我國生育政策的放開，居民生育需求大幅增加，但其中有10%～15%的有生育意愿的夫婦患有不孕不育癥[5]，使得我國輔助生殖總周期數一直呈上升的趨勢。精子對卵子的激活是IVF技術的關鍵步驟[6]，精子形態是重要的精子基礎參數，直接影響精子的功能[7-8]。正常形態精子百分率對胚胎發育的影響目前尚不明確。有研究結果顯示，正常形態精子百分率不影響胚胎發育[9-10]；但也有學者采用世界衛生組織精液分析評判標準[4]，發現正常精子形態會影響IVF的胚胎發育[11-13]；但這些研究均未提及精液標本是否收集于IVF取卵當日。由于男性精液質量有一定的波動性，所以本研究嚴格篩選了單純因女方輸卵管因素行IVF的非高齡女性，男方未見器質性異常，且獲卵數≥3個的IVF周期。收集取卵當日獲取的新鮮精液，并進行優化處理，使前向精子總數＞10×106/mL。 由于無法將評估后的精子再用于IVF，多數胚胎實驗室SOP未將精子形態作為IVF常規檢測。本研究發現，優化處理后的正常形態精子百分率對胚胎發育過程中的受精率、卵裂率、異常受精率和優質胚胎率無影響（P＞0.05），但對有效胚胎率有顯著影響（P=0.038），提示精子形態缺陷可能對胚胎的發育有負面影響。NIKOLOVA等[14]也證實了這一結論，他們對精子形態、活率以及DNA碎片與胚胎形態動力學及IVF臨床妊娠結果的相關性進行了分析，發現精子缺陷（卷尾、頭部缺陷和多重缺陷）不僅對胚胎形態動力學有影響，對臨床妊娠率亦有顯著影響。因此，IVF當日精子形態分析可作為臨床結果的潛在預測因子[14]。正常形態精子百分率相對較低的患者，精子頭部可能存在內部缺陷，而精子頭部缺陷主要影響胚胎發育的最后階段，精子中段缺陷與胚胎卵裂有關，尾部缺陷與胚胎的早期發育有關。已有研究證實了精子質量可能與精子的染色質區域組裝分離是否存在異常、精子DNA的完整和凋亡[15-16]、精子是否存在于高濃度的活性氧（reactive oxygen species，ROS）環境有關[17]。 高濃度的ROS會對精子的DNA造成損傷，從而導致精子的DNA產生單鏈或雙鏈斷裂?；谙嚓P研究的推測，本研究對精液進行了優化處理，去除不活動的死精子和精液中的白細胞，以及少量原始細胞，降低ROS水平，從而優化整體精液參數。有研究發現，精液優化處理可以顯著提高精子正常形態百分率，優化精子質量[18]，降低ROS，減少精子的損傷，從而提高精卵結合后正常發育的可能性[19]，凸顯了精液優化處理的重要性。本研究結果顯示，高正常形態精子百分率可顯著增加有效胚胎率，提示精液優化處理后，正常形態精子百分率可用于預測胚胎實驗室中胚胎發育的結局。

綜上所述，對因女方輸卵管因素而導致不孕、男方在生育能力上不存在器質性異常的夫婦，建議在進入IVF治療周期前，先行優化處理后的精子形態學檢查，評估正常形態精子百分率的水平，相對較高的正常形態精子百分率有利于IVF時在胚胎培養過程中得到相對較好的胚胎結局；而對于即使在精液優化處理后，正常形態精子百分率僅高于參考區間的患者，建議先行早期男科臨床治療干預措施，以輔助提高精子形態質量，提高有效胚胎率，從而獲得更好的胚胎結局，改善IVF治療的結局。