宏基因組二代測(cè)序在粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患者病原菌 檢測(cè)中的價(jià)值

溫 靜， 史 瑞， 謝 佳， 劉 鋒， 李 光， 任婧婧， 雷小茹， 郭曉波， 宋艷萍

（西安市中心醫(yī)院 西安市血液病研究所，陜西 西安 710002）

中性粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱在血液系統(tǒng)腫瘤患者中有著極高的發(fā)病率[1]。該病進(jìn)展迅速，若得不到及時(shí)、有效的控制，可危及生命。中性粒細(xì)胞缺乏會(huì)使免疫反應(yīng)被抑制，發(fā)熱通常是感染的唯一表現(xiàn)，迅速鑒別和有效預(yù)防感染可以延長(zhǎng)患者生存期，并提高生存質(zhì)量[2]。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室主要依靠微生物培養(yǎng)、16S rRNA及免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)尋找病原，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性和特異性差等不足，診斷通常具有局限性。為盡快控制感染，臨床通常需要在準(zhǔn)確的病原檢測(cè)結(jié)果出來(lái)前采取經(jīng)驗(yàn)性治療，這也會(huì)導(dǎo)致一定程度的不合理治療、誘導(dǎo)耐藥、不可預(yù)期的不良反應(yīng)及醫(yī)療資源浪費(fèi)。所以，盡早明確病原至關(guān)重要[3]。

宏基因組二代測(cè)序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）技術(shù)能同時(shí)對(duì)上億個(gè)微生物DNA片段進(jìn)行檢測(cè)，可直接從樣本中提取微生物核酸，進(jìn)行大規(guī)模、無(wú)差別的檢測(cè)，利用檢測(cè)信息，對(duì)照現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)，分析出病原菌的種屬，甚至可以預(yù)測(cè)病原菌的耐藥情況[4]，目前已逐步應(yīng)用于血液科、神經(jīng)內(nèi)科、感染科、重癥監(jiān)護(hù)病房、兒科患者病原的檢測(cè)中[5-9]。但尚無(wú)mNGS用于檢測(cè)化療后粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患者的報(bào)道。為此，本研究擬比較mNGS、傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)檢測(cè)病原的效能，為臨床決策提供 參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2019年6月—2020年9月西安市中心醫(yī)院化療后發(fā)生粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱的患者19例，其中男10例、女9例，年齡31～79歲。樣本送檢時(shí)患者中性粒細(xì)胞為（0.22±0.19）× 109/L，序貫器官衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）評(píng)分為（4.79±3.61）分，發(fā)熱天數(shù)為（18.2±9.3）d。19例患者基本臨床資料見(jiàn)表1。

1.2 病例入選、排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 入選標(biāo)準(zhǔn) 化療后中性粒細(xì)胞＜0.5×109/L持續(xù)時(shí)間超過(guò)1周；不同日體溫＞38 ℃ 3次。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 因各種原因拒絕進(jìn)行相關(guān) 檢查。

表1 19例患者基本臨床資料

1.3 方法

1.3.1 mNGS （1）樣本采集和處理：采集患者靜脈血、腦脊液、胸腹水各3 mL，置于游離DNA樣本保存管中。血液樣本采集后置于抗凝管中，4 ℃ 425×g離心10 min，分離血漿后取500 μL血漿，再4 ℃ 27 173×g離心10 min，取上清450 μL，采用Magnetic Circulating DNA Maxi Kit[批號(hào)DP720，天根生化科技（北京）有限公司]提取循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）；取400 μL胸腔積液/腹腔積液或腦脊液樣本，加入玻璃珠和裂解液混合破壁10 min， 采用Magnetic Circulating DNA Maxi Kit提取DNA，采用TIANamp Virus RNA Kit[批號(hào)DP315-R，天根生化科技（北京）有限公司]提取RNA。（2）文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序：采用ieff NGS Ultima DNA Library Prep Kit[批號(hào)12199，翌圣生物科技（上海）股份有限公司]構(gòu)建cfDNA文庫(kù)，采用TIANSeq DirectFast DNA Library Prep Kit[批號(hào)NG101，天根生化科技（北京）有限公司）]構(gòu)建DNA文庫(kù)，采用Hieff NGS Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit [批號(hào)12252，翌圣生物科技（上海）股份有限公司]構(gòu)建RNA文庫(kù)；采用NextSeq 550臺(tái)式測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行高通量測(cè)序。（3）數(shù)據(jù)分析：采用BWA軟件（http://bio-bwa.sourceforge.net）將測(cè)序數(shù)據(jù)與人基因組進(jìn)行比對(duì)，去除人源序列和重復(fù)序列，將剩余測(cè)序數(shù)據(jù)與細(xì)菌（10 537種）、真菌（903種）、病毒（8 472種）、寄生蟲(chóng)（288種）、螺旋體（89種）整合后的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定檢出微生物序列數(shù)，根據(jù)序列數(shù)和臨床相關(guān)信息判斷可能的病原。

1.3.2 微生物培養(yǎng) 采用無(wú)菌采血法采集患者高熱、寒戰(zhàn)但尚未使用抗菌藥物時(shí)的血液樣本8～10 mL，注入專(zhuān)用血培養(yǎng)瓶中（需氧瓶和厭氧瓶各1瓶），搖勻，2 h內(nèi)送檢。采用BACT/ACERT 3D全自動(dòng)細(xì)菌監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）培養(yǎng)5 d。

1.3.3 免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè) 采用顯色法真菌（1-3）-β-D葡萄糖監(jiān)測(cè)試劑盒（天津丹娜生物科技公司）進(jìn)行G試驗(yàn)，采用酶聯(lián)免疫法曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒（美國(guó)伯樂(lè)公司）進(jìn)行GM試驗(yàn)。革蘭陰性菌脂多糖（Gram-negative bacterium lipopolysaccharide，GNBL）檢測(cè)：用一次性無(wú)菌、無(wú)熱源真空采血管采集患者靜脈血4 mL， 1 700×g離心10 min，收集血清0.1 mL，加入含0.9 mL樣本處理液中混勻，70 ℃孵育10 min，取出后立刻放入冷卻槽中5 min，制備成待測(cè)血清樣本，取0.2 mL制備的血清樣本直接加入酶反應(yīng)主試劑中，溶解混勻后，用微量加樣器全部移至（9×65）mm標(biāo)準(zhǔn)無(wú)熱源平底試管中（不能產(chǎn)生氣泡），立即采用MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)（北京金山川公司）進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用x ±s表示，2個(gè)組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料用例表示，組間比較采用Fisher精確概率法或χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)mNGS、微生物培養(yǎng)和免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)檢出病原菌的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 送檢樣本類(lèi)型

19例送檢樣本中，血液樣本8例、咽拭子樣本7例、腦脊液樣本1例、胸腔積液樣本和腹腔積液樣本2例、尿液樣本1例。

2.2 3種方法病原菌檢測(cè)結(jié)果比較

19例樣本中，mNGS、微生物培養(yǎng)、免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)陽(yáng)性率分別為68.4%、26.3%、63.2%。13例mNGS陽(yáng)性樣本中，10例檢出革蘭陰性菌、4例檢出革蘭陰性菌、4例檢出真菌、3例檢出病毒、1例檢出支原體。見(jiàn)表2。

表2 19例樣本mNGS、微生物培養(yǎng)、免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表2

2.3 3種方法檢出病原菌所需時(shí)間比較

mNGS、微生物培養(yǎng)、免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)檢出病原菌所需時(shí)間分別為（47.0±13.2）、（84.0±31.6）、（24.8±16.4）h；與微生物培養(yǎng)比較，mNGS和免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)所需時(shí)間更短（P＜0.05）；mNGS與免疫學(xué)檢測(cè)所需時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 3種方法病原菌檢測(cè)效能比較

ROC曲線分析結(jié)果顯示，mNGS、微生物培養(yǎng)、免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)檢出病原菌的曲線下面積分別為0.806、0.688、0.550；3種方法比較，敏感性和特異性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖1。

表3 3種方法檢測(cè)病原的效能比較

圖1 mNGS、微生物培養(yǎng)、免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)檢出 病原菌的ROC曲線

3 討論

粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱是惡性腫瘤患者化療后常見(jiàn)的并發(fā)癥，在實(shí)體腫瘤患者中的發(fā)病率為40%～70%，而急性白血病患者的發(fā)病率高達(dá)80%[4-5]。多年來(lái)，臨床對(duì)粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患者的治療策略是廣覆蓋抗感染治療[6]，但導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱的病原菌種類(lèi)繁多，盡早鑒別出病原菌種類(lèi)對(duì)于有效治療和改善預(yù)后有著至關(guān)重要的意義，對(duì)減少抗菌藥物濫用、減少病原菌所致臟器毒性和節(jié)省醫(yī)療資源也有重要意義[7]。傳統(tǒng)病原菌檢測(cè)方法包括細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)、免疫/血清相關(guān)抗原檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)。然而，傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在陽(yáng)性率低、特異性差、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，迫切需要新的檢測(cè)方法[8]。

mNGS是一種新的病原菌檢測(cè)技術(shù)，對(duì)待檢樣本進(jìn)行全基因組測(cè)序，能夠檢出生長(zhǎng)緩慢的病原菌，且不受抗菌藥物干擾，還能夠發(fā)現(xiàn)未知、罕見(jiàn)的微生物[9]。2008年，有學(xué)者首次通過(guò)mNGS技術(shù)檢測(cè)出一種新型病毒——沙礫病毒，此后該方法逐漸被應(yīng)用于感染性疾病的診斷[10]。

有研究發(fā)現(xiàn)，78.1%的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和35.7%的循環(huán)系統(tǒng)感染是通過(guò)mNGS診斷的，但在呼吸系統(tǒng)感染中，僅有21.4%是通過(guò)mNGS診斷的[7]，提示臨床更傾向于將mNGS技術(shù)用于腦脊液和血液等相對(duì)無(wú)菌樣本的檢測(cè)。本研究19例樣本中，有8例血液樣本，但咽拭子樣本也較多（7例），主要是因?yàn)椴糠只颊叽嬖诿黠@的呼吸道癥狀，但因?yàn)榛熀罅＜?xì)胞缺乏常合并血小板水平下降，無(wú)法耐受肺泡灌洗，所以送檢樣本類(lèi)型為咽拭子。本研究同時(shí)對(duì)所有樣本采用微生物培養(yǎng)、免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)和mNGS進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，mNGS陽(yáng)性率為68.4%，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果[11-13]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在13例mNGS陽(yáng)性樣本中，革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌、真菌、病毒、支原體檢出例數(shù)分別為10、4、4、3、1例，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果[1]一致。本研究19例樣本中，7例檢出單一病原，12例檢出2種及以上病原，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié) 果[14]一致。此外，在檢測(cè)所需時(shí)間上，mNGS顯著少于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)（P＜0.05），但與免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究結(jié)合患者病史、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和臨床表現(xiàn)，嚴(yán)格區(qū)分感染、定植、污染菌，ROC曲線分析結(jié)果顯示，mNGS檢出病原菌的敏感性為72.10%，特異性為68.46%，敏感性與微生物培養(yǎng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果（mNGS對(duì)病原菌檢測(cè)的敏感性為50.70%～67.53%，特異性為68.75%～85.70%，敏感性與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）[10，15]一致。本研究結(jié)果顯示，mNGS檢測(cè)病原菌的約登指數(shù)顯著高于微生物培養(yǎng)和免疫學(xué)相關(guān)檢測(cè)，提示mNGS檢測(cè)可靠性更高。

但mNGS檢測(cè)也存在著一定的局限[16]，如測(cè)序結(jié)果解讀、假陰性結(jié)果判讀、成本高等，這些局限是未來(lái)改進(jìn)的方向。本研究也有一定的不足之處，如樣本量偏少，可能存在觀察結(jié)果偏移，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析。同時(shí)，本研究未針對(duì)其他常見(jiàn)感染指標(biāo)，如降鈣素原、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素6、16s rRNA進(jìn)行對(duì)照，這也是未來(lái)進(jìn)一步分析的方向。

綜上所述，mNGS能夠提高化療后粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患者病原菌檢出率，縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)敏感性和診斷可靠性，在診斷化療后粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱中具有一定的優(yōu)勢(shì)。