基因芯片技術在腎移植術后患者肺部感染病原菌 快速檢測中的臨床價值

李達明， 呂 星， 蔣傳好， 胡 敏

（中南大學湘雅二醫院檢驗科，湖南 長沙 410000）

為了防止移植排斥反應，腎移植術后患者需長期服用免疫抑制劑，這會使機體的免疫功能受到影響，增加感染的風險，其中泌尿系感染最為常見，但是肺部感染的病死率最 高[1]。早期診斷和治療有助于有效控制病情，但由于接受免疫抑制治療導致患者免疫功能低下，炎癥反應往往不典型，病情很難被及時發現。細菌培養是診斷細菌感染的金標準，但是由于細菌培養周期較長，細菌生長的體內、體外條件不能達到完全相同，導致檢出率不高，容易耽誤治療。近年來，分子生物技術已成為傳統細菌感染診斷方法的重要補充，也是快速診斷病原菌的主要研究方向。基因芯片技術是一種新型核酸檢測方法，在細菌感染檢測中具有耗時短、操作簡單等優點。本研究將基因芯片技術與細菌培養檢測腎移植術后患者肺部感染病原菌的應用效果進行比較，分析基因芯片技術在此類感染中的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2018年11月—2019年12月中南大學湘雅二醫院290例腎移植術后患者[男195例、女95例，年齡（40.87±11.31）歲]的呼吸道樣本（痰樣本136例、肺泡灌洗液樣本152例、咽拭子樣本2例）。根據是否發生肺部感染，分為肺部感染組[149例，其中男101例、女48例，年齡（41.56±10.92）歲]和非肺部感染組[141例，其中男94例、女47例，年齡（39.65±10.89）歲]。肺部感染診斷標準根據中華醫學會呼吸病學分會2016年發布的《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南》[2]：（1）社區發病；（2）新近出現的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；發熱；肺實變體征和（或）聞及濕性啰音；白細胞＞ 10×109/L或＜4×109/L，伴或不伴細胞核左移；以上任意1項；（3）胸部X線檢查顯示片狀、斑片狀浸潤性陰影或間質性改變，伴或不伴胸腔積液。排除肺結核、肺部腫瘤、非感染性肺間質性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸性粒細胞浸潤癥及肺血管炎患者。本研究經中南大學湘雅二醫院倫理委員會審核通過。

1.2 儀器和試劑

北京博奧晶典生物技術有限公司呼吸道病原體核酸檢測試劑盒、RTisochip-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀。美國BD公司Phoenix 100全自動微生物分析系統及配套細菌鑒定/藥敏板。鄭州貝瑞特生物技術有限責任公司哥倫比亞血瓊脂培養基、沙保弱葡萄糖瓊脂培養基/中國藍瓊脂二分格培養基。江門凱林貿易有限公司嗜血桿菌巧克力瓊脂培養基。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集患者術后次日晨起后經清水反復漱口后的痰樣本136例，經支氣管纖維鏡沖洗后的肺泡灌洗液樣本152例，咽拭子 2例。及時送檢。

1.3.2 細菌培養與鑒定 將留取的臨床樣本接種于哥倫比亞血瓊脂培養基和沙保弱葡萄糖/中國藍二分格培養基、嗜血桿菌巧克力瓊脂培養基上，置于35 ℃、5% CO2培養箱中培養18～ 24 h，采用Phoenix 100全自動微生物分析系統及配套細菌鑒定/藥敏板進行菌種鑒定。

1.3.3 基因芯片技術檢測 采用呼吸道病原體核酸檢測試劑盒配套的核酸提取試劑，按照其說明書要求處理呼吸道樣本，并進行核酸提取。提取核酸后，采用RTisochip-A恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀進行擴增，結合配套的軟件分析，可一次性檢測12種常見呼吸道病原體：肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、結核分枝桿菌復合群、肺炎支原體、肺炎衣原體。檢測完成后，采用最大二階導數法結合其他算法計算出“S型”擴增曲線進入快速擴增期的第1個拐點，拐點對應的時刻與原點時刻的差值定義為Tp值，結合Tp值陽性判斷值進行結果判讀。“熒光曲線區域”顯示歸一化曲線，“檢測結果”區域顯示質控結果和各檢測指標的檢測結果。當檢測指標的Tp值≤陽性判斷值時，判讀為陽性；當檢測指標的Tp值＞陽性判斷值時，判讀為陰性。

1.4 統計學方法

采用 SPSS 25.0 軟件進行數據分析。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2種方法檢測結果

2 9 0例樣本中，細菌培養陽性5 0例（17.24%），包括11種病原菌，以革蘭陰性桿菌為主（36株，72.00%），其中肺炎克雷伯菌9株（18.00%）、嗜麥芽窄食單胞菌和銅綠假單胞菌各6株（12.00%）；基因芯片技術檢測陽性84例（28.97%），包括11種呼吸道病原菌，其中肺炎克雷伯菌17株（20.24%）、流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌各16株（19.05%）。見表1。

表1 細菌培養與基因芯片技術陽性檢測結果 株

2.2 基因芯片技術、細菌培養檢測結果與臨床診斷比較

290例患者中，基因芯片技術檢出84例陽性、2 0 6例陰性，臨床敏感性為6 5.4 8%（55/84），臨床特異性為54.37%（112/206）；二者差異有統計學意義（χ2=8.62，P＜0.01）。細菌培養檢出50例陽性、240例陰性，臨床敏感性為64.00%（32/50），臨床特異性為51.25%（123/240）；二者差異無統計學意義（χ2=3.266，P=0.07）。以臨床診斷為標準，基因芯片技術的陽性預測值為36.91%（55/149），陰性預測值為79.43%（112/141）；細菌培養的陽性預測值為21.48%（32/149），陰性預測值87.23%（123/141）。見表2。

表2 基因芯片技術、細菌培養檢測結果與臨床診斷比較例

3 討論

目前，臨床治療終末期腎臟疾病的方法主要是腎移植術，然而腎移植術往往伴隨著很多風險。為盡量避免術后可能產生移植物抗宿主反應和宿主抗移植物反應等排斥反應，患者術后需要長期、大劑量服用免疫抑制劑，導致患者免疫功能低下，易發生一系列可能危及生命的并發癥，其中最容易發生的就是感染[1]。有研究結果顯示，有70%的腎移植患者術后3年內發生過感染[3]。我國的相關統計數據顯示，9%～16%的腎移植患者術后會出現肺部感染[4]，腎移植術后3個月左右是細菌感染的高發階段，其感染部位多為泌尿系統和呼吸系統，尤其是呼吸系統感染，起病隱匿、進展迅速，病死率為28.3%～37.9%[5-6]，重度肺部感染病死率甚至可達40%～72%[7]。因此，早期確定腎移植患者術后肺部感染的病原菌，可有效幫助臨床選用敏感抗菌藥物，不僅能夠達到更好的治療效果，還能避免盲目使用大量廣譜抗菌藥物導致的不良后果。很長一段時間以來，臨床微生物實驗室確定呼吸系統感染病原菌主要是采用細菌培養的方法，該方法也一直被視為細菌感染檢測的金標準。但是細菌培養耗時長，從培養細菌、鑒定，直至得出藥物敏感性結果，往往需要超過48 h；此外，由于某些苛養菌在一般的培養基上不能生長，從而存在著較高的漏檢風險；同時，臨床在腎移植術后常會預防性使用抗菌藥物控制感染，也會導致病原菌無法被培養出來，出現假陰性結果，這些都會進一步影響臨床治療效果。

本研究采用基因芯片技術進行腎移植術后肺部感染患者病原菌檢測。環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等在2000年開發出來的核酸擴增技術，從核酸提取到最終結果報告只需2 h左右，其檢測呼吸道病原體陽性率可達40%～60%[8-10]。而目前傳統的細菌培養方法陽性結果報告時間為66～115 h[11]，且陽性檢出率一般低于20%[12]，故基因芯片技術相對于傳統培養方法，大大縮短了檢驗時間，提高了病原菌檢出率，檢測效率大幅提高，有助于及時指導臨床合理使用抗菌藥物。

本研究發現，基于LAMP的快速基因芯片技術更加靈敏，臨床敏感性達65.48%，略高于細菌培養（64.00%），其中4株結核分枝桿菌復合群基因芯片技術檢測結果為陽性，而細菌培養為陰性。通常來說，結核分枝桿菌培養需要在羅氏培養基上培養42 d才能生長出來，普通的血瓊脂培養基的營養條件難以滿足該種細菌的生長需求；此外，基因芯片技術檢測出流感嗜血桿菌16株、肺炎鏈球菌4株、肺炎支原體6株、肺炎衣原體3株，而細菌培養均未檢出，這很有可能是因為人正常呼吸道中有大量的正常菌群，它們很容易在培養基上生長，從而覆蓋了病原菌，使臨床漏檢率升高。同樣，由于感染也有可能是多種病原菌造成的，其中1種致病菌在培養皿上的生長速度更快，會導致微生物檢測人員在觀察培養皿時遺漏其他病原菌。李輝騰等[13]的研究結果顯示，基因芯片技術特異性強、穩定度高，能快速、準確地檢出嗜肺軍團菌。楊俊發等[14]的研究也證實了基因芯片技術可高靈敏度、高特異性和高穩定性地檢出肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌。楊艷兵等[15]發現基因芯片技術檢測白念珠菌也有著高靈敏度和高特異性。上述幾種非典型肺部感染病原菌在常規條件下難培養，或難以判斷是否為致病菌，因此，僅進行常規細菌培養很容易造成漏檢。本研究也發現了基因芯片技術的局限性，由于本研究所用基因芯片的設計僅能檢測10種臨床常見的病原菌，故由其他病原菌導致的感染無法被診斷；細菌培養檢出的皮氏伯克霍爾德菌、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜酸假單胞菌、惡臭假單胞菌、頭狀葡萄球菌、陰溝腸桿菌、抗壞血酸克呂沃爾菌、念珠菌、曲霉菌，該基因芯片均未檢出，提示在基因芯片技術和細菌培養的一致性降低的同時，也會導致基因芯片技術的特異性不如細菌培養。

綜上所述，基因芯片技術在腎移植患者術后感染病原菌快速檢測中有較高的敏感性，但受限于芯片的設計，特異性不理想。建議在腎移植術后患者中若發生可疑肺部感染，可優先應用基因芯片技術來進行初步判斷，再通過細菌培養加以證實。