BNIP3在胰腺癌中的表達及其與術后吉西他濱化療敏感性的關系

王喆，史俊芬，張強，楊尚儒，王昭，荊鑫，李佳幸，池治宣

（1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院 急診科，北京 100020；2.內蒙古醫科大學附屬醫院 肝膽胰脾外科，內蒙古 呼和浩特 010000）

胰腺癌是惡性程度高、病情發展迅速、預后差的消化系統腫瘤。由于發病初期其臨床癥狀并不明顯，發現時大多數已成為晚期，其5 年生存率不足10%[1]。目前手術切除依然是可以根治胰腺癌的治療方案，但是由于大多數胰腺癌發病時較為隱匿，已經失去了行根治性手術的機會；而對于接受手術的患者來說，手術效果也不盡理想，通常通過術后輔助化療延長生命，因此手術切除聯合術后輔助化學治療是目前治療胰腺癌的首選方案[2]。在目前的輔助化療方案中，應用吉西他濱或者以吉西他濱為主的聯合化療較為普遍。通過術后隨訪調查發現胰腺癌患者中應用該化療方案的效果卻各不相同，多數是由于腫瘤對吉西他濱類藥物產生了耐藥性，從而導致化療效果不佳，影響腫瘤的治療[3-4]。

Bcl-2/腺病毒E1B-19k相關蛋白3（Bcl-2/E1B-19k-interacting protein 3，BNIP3）屬于BH3-only促凋亡蛋白亞類的線粒體蛋白，是一種促凋亡蛋白[5]。BNIP3的分子中含有凋亡效應結構域（BH3結構域）和COOH-末端的跨膜結構區（TM結構區）。通過BH3 結構域，BNIP3 與抗凋亡蛋白結合形成異二聚體，抑制蛋白的抗凋亡功能，繼而介導細胞凋亡[6]。而TM結構區位于細胞膜內，具有親水性的特點，如果缺失會促進缺氧誘導的細胞凋亡[7]。實體腫瘤有個典型的特征—缺氧。低氧環境下，組織細胞發生細胞代謝的改變以及氧化應激損傷，影響了細胞存活的時間。而腫瘤細胞卻可以激活生存期適應機制，對抗這種細胞環境從而推進腫瘤的進展[8]。

吉西他濱是二氟核苷類抗代謝藥物，具有細胞周期特異性，主要在腫瘤細胞DNA的合成期中發揮作用。在進入細胞后，吉西他濱被脫氧胞苷激酶磷酸化，繼而形成雙氟脫氧胞苷二磷酸和雙氟脫氧胞苷三磷酸活性產物，進一步抑制DNA的合成以及與鳥苷配對，使DNA鏈合成停止，進而DNA斷裂，腫瘤細胞死亡，最后通過胞苷脫氧酶代謝失活[9]。作為胰腺癌化療的常用藥物，在實際應用過程中個體差異明顯，對吉西他濱的藥物敏感性不同是影響患者總生存時間和無病生存時間的主要因素。有報道稱BNIP3的高表達可能會導致胰腺癌對藥物治療的耐藥性增大[4]；但也有研究發現BNIP3的高表達與胰腺癌術后應用吉西他濱化療不佳并不存在關聯[10]。

本實驗分析內蒙古醫科大學附屬醫院近5 年胰腺癌患者在行手術治療后應用吉西他濱進行化療的效果，通過測定腫瘤組織中BNIP3 的表達量，對比使用吉西他濱化療預后的個體情況，分析BNIP3 的表達量與吉西他濱化療敏感性之間存在的關聯。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性分析內蒙古醫科大學附屬醫院2016 年7月至2021年8月共58例胰腺癌根治術患者的臨床資料，術后經病理確診為胰腺癌，病理類型為導管腺癌。共納入55例免疫組織化學標本，剔除 3例未成功進行免疫組織化學染色。

納入標準：（1）病理標本適用于免疫組織化學實驗；（2）術前并未進行任何形式的化療及放療；（3）術后規律應用吉西他濱輔助化療或以吉西他濱為主的聯合化療；（4）臨床資料完整；（5）術后可以進行定期隨訪。排除標準：（1）有嚴重基礎疾病、腫瘤向遠處轉移無法完整切除以及行姑息手術者；（2）圍手術期出現嚴重并發癥，包括：C級胰瘺、嚴重腹腔感染、腹腔出血、死亡；（3）患者預期失訪可能性大，以及未規律隨訪或失訪。

1.2 免疫組織化學分析及分組方法

根據腫瘤細胞的染色強度及染色范圍綜合評分。腫瘤細胞的染色強度分4 級，以同一切片中淋巴細胞的染色強度進行標準化。0分：無著色，呈陰性；1分：淺著色，即腫瘤細胞的染色強度低于淋巴細胞；2分：中等著色，腫瘤細胞與淋巴細胞的染色強度相當；3分：強著色，即腫瘤細胞高于淋巴細胞的染色強度。染色范圍計分：即根據陽性細胞占所有腫瘤細胞的比例進行評分。0分：陽性細胞或比例＜1%，1 分：≤10%陽性，2 分：11%～25%陽性，3分：26%～50%陽性，4分：＞50%陽性。BNIP3的染色水平評分由染色強度計分與染色范圍計分相加而成，陰性：≤2分，弱陽性：3～4分，陽性：5～6分，強陽性：≥7分。將表達陰性及弱陽性判定為BNIP3低表達組，判定陽性及強陽性為BNIP3高表達組。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，正態分布數值以（）表示，計量資料選用t檢驗或方差分析。計數資料則采取χ2檢驗，對于期望值小于5的變量，采用Fisher精確檢驗。用Kaplan-Meier分析總生存時間（overall survival，OS）和無病生存時間（disease free survival，DFS）與BNIP3蛋白水平的相關程度。最后用Cox回歸多因素生存分析患者獨立預后因素，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同BNIP3蛋白表達水平的胰腺癌根治術患者生存分析

利用Kaplan-Meier法進行生存分析，與BNIP3低表達組比較，BNIP3高表達組的OS [（13（95%CI11.378～14.622）個月vs18（95%CI16.592～19.408）個月]和DFS [7（95%CI4.082～9.938）個月vs14（95%CI12.936～15.064）個月]均降低（P＜0.05）。見圖1、2。

圖1 BNIP3表達水平和OS的生存曲線

2.2 BNIP3的蛋白表達水平與患者預后的多因素分析

將患者的性別、年齡、民族、長期飲酒、腫瘤位置、腫瘤最大徑、病理分化程度、TNM分期、手術方式等資料納入Cox回歸多因素生存分析中。結果顯示，胰腺癌組織BNIP3 的表達量（HR0.317，95%CI0.158～0.635）、腫瘤T分期（HR2.314，95%CI1.111～4.820）以及淋巴轉移（HR0.282，95%CI0.114～0.696）是OS的獨立預后因素（均P＜0.05），見表1。BNIP3的表達量（HR0.272，95%CI0.133～0.559）和淋巴轉移（HR0.281，95%CI0.117～0.676）是DFS的獨立預后因素（均P＜0.05），見表2。

表1 胰腺癌患者術后OS的單因素及多因素分析

表2 胰腺癌患者術后DFS的單因素及多因素分析

2.3 BNIP3的蛋白表達水平與臨床資料的聯系

通過對胰腺癌患者臨床資料與BNIP3蛋白表達水平的比較（見表3），年齡、腫瘤最大徑的差異對于BNIP3的蛋白表達水平未產生影響，差異無統計學意義（P＞0.05）。而性別、民族、腫瘤位置和病理分化程度等因素的不同與BNIP3的蛋白表達水平相比，同樣無統計學意義（P＞0.05）。本次實驗發現胰腺癌患者的臨床資料與BNIP3的蛋白表達水平無相關性，即年齡、性別、民族、腫瘤位置、腫瘤最大徑、病理分化程度等暫時不能認為對BNIP3的蛋白表達有影響，BNIP3蛋白表達水平的調控可能與其他因素有關。

表3 胰腺癌BNIP3蛋白表達與胰腺癌患者臨床資料比較

圖2 BNIP3表達水平和DFS的生存曲線

3 討論

胰腺癌是致命的惡性腫瘤之一，以手術結合吉西他濱或以吉西他濱為主的聯合化療成為控制并治療腫瘤進展的主要方案。當能夠預測對于吉西他濱的耐藥情況時，就會對術后的輔助化療起關鍵作用，同時推動個體化方案的進行[11]。本研究發現BNIP3低表達的患者比BNIP3 高表達應用吉西他濱術后化療具有更佳的臨床效果，生存時間更長，可能對藥物敏感。同時實驗結果表明在對患者一般資料進行分析后，對于應用吉西他濱進行化療的患者，其OS的獨立預后因素包括胰腺癌BNIP3的表達量、分化程度、淋巴結轉移，而BNIP3 的表達水平、分化程度是DFS的獨立預后因素。對于BNIP3的表達是否會影響應用吉西他濱的獲益程度存在著較大的爭議，Li等[12]報道BNIP3的高表達與胰腺癌的發生發展有關，BNIP3 低表達的患者有著更高的總生存率。該研究選取70例胰腺癌組織，發現BNIP3表達與腫瘤分期和臨床分期參數之間存在統計學差異，其余相關參數與BNIP3的表達無相關性。通過比較胰腺癌患者術后的生存時間與BNIP3表達的關系發現，BNIP3 較低表達的胰腺癌患者術后生存時間較長。淋巴結轉移、臨床II期和BNIP3較高表達的患者與癌癥死亡風險的增加有明顯的相關性。多因素分析顯示臨床分期和淋巴結轉移是影響預后的關鍵因素，BNIP3 表達水平是胰腺癌的獨立預后指標。同時Li等[12]通過Western blotting分析發現miR-27a-3p與BNIP3呈負相關，BNIP3的表達減少通過miR-27a-3p激活MAPK信號通路，從而抑制腫瘤生長。本研究也得到了類似的結果，在胰腺癌細胞中BNIP3 的地表達水平可能會給患者帶來更長的生存期，同時腫瘤的分化程度也影響著患者的預后。其原因可能是因為BNIP3的蛋白表達水平與腫瘤缺血缺氧的嚴重程度相關，隨著腫瘤壞死的程度增加，其表達水平越高，有待進一步實驗驗證。

但一些研究對此持相反觀點。2005年Akada等[13]的研究中就發現，BNIP3 表達的減少可能與胰腺癌對吉西他濱的耐藥性有關。在胰腺癌的細胞株中BNIP3 的表達均呈現不同程度的減少，尤其是在耐藥細胞系中，BNIP3 的表達水平下降更明顯。實驗通過提取胰腺癌患者組織中的mRNA，進行實時定量RT-PCR分析，發現BNIP3 mRNA水平大部分低于正常對照組織，在進行Western blotting實驗后證實BNIP3 的siRNA抑制了BNIP3 的表達，進而降低吉西他濱對胰腺癌細胞的細胞毒性，在胰腺癌細胞系模型中通過發揮PI3K/Akt通路在吉西他濱耐藥中的作用展示了BNIP3 對吉西他濱敏感性的影響。BNIP3表達的降低最終增加了對吉西他濱的耐藥性，顯著降低了胰腺癌患者的生存率。但由于在該實驗中僅提取了部分患者的胰腺癌組織，考慮到樣本數不足，會存在選擇偏倚。但對患者術后未進行規律性隨訪，對于術后存活時間無明顯對比。Erkan等[14]的研究結果表明BNIP3的低表達的患者具有較短的生存期。隨后通過研究吉西他濱對BNIP3修飾細胞的細胞毒作用，結果發現BNIP3 的沉默表達通常與化療耐藥的增加有關。在胰腺癌晚期，BNIP3 的丟失可能會產生更具侵襲性的腫瘤表型，并且至少在一定程度上促成了這種惡性腫瘤的化療耐藥。而在Okami等[15]的進一步研究中，發現BNIP3 是胰腺癌的腫瘤抑制因子，同時研究表明BNIP3 的低表達是胰腺癌細胞適應缺氧條件的一種分子機制。在缺氧條件下，誘導BNIP3 的表達使胰腺癌細胞對缺氧更加敏感，BNIP3 在胰腺癌中的頻繁失活及其作為凋亡誘導物的作用支持了該分子作為腫瘤抑制因子的作用。這可能是由于BNIP3低表達的腫瘤細胞對誘導凋亡的敏感性降低所致。因此，BNIP3 高表達的胰腺癌患者具有較高的總生存率[4]

胰腺癌患者術后使用吉西他濱化療的BNIP3蛋白低表達比BNIP3高表達的患者有更長的總生存時間和無病生存時間，對吉西他濱藥物更加的敏感。BNIP3可作為胰腺癌術后應用吉西他濱療效的預測性標志物，從而為患者選擇更好的化療藥物。BNIP3在胰腺癌中的表達程度和病理分化程度無關聯，但兩者共同影響OS和DFS。在胰腺癌中BNIP3的表達調控機制復雜，其相關機理以及影響因素仍然需要進一步深入研究。