miR-199b-5p調(diào)控HAPLN1對宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響

韓朝輝 龍靜 劉潔玲 陳學(xué) 王靜

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在全球女性常見惡性腫瘤中發(fā)病率排名第四，大多數(shù)患者進(jìn)行治療時，已進(jìn)入疾病中晚期，因而治愈困難，易復(fù)發(fā)，對女性的生命健康造成嚴(yán)重威脅[1,2]。化療是宮頸癌的主要臨床治療手段，順鉑(cisplatin，DDP)作為化療一線藥物，廣泛應(yīng)用于宮頸癌，特別是晚期宮頸癌的治療，但長期應(yīng)用順鉑易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響療效，導(dǎo)致治療失敗[3,4]。miR-199b-5p是一種腫瘤抑制因子，可介導(dǎo)調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲遷移和化療耐藥過程，上調(diào)其表達(dá)，可減輕大腸癌的遠(yuǎn)處遷移，抑制三陰乳腺癌的裸鼠異種移植瘤生長，降低其增殖和侵襲遷移能力，并減弱其順鉑耐藥性[5,6]；另外有研究發(fā)現(xiàn)，miR-199b-5p在宮頸癌組織中表達(dá)水平比較正常宮頸組織明顯降低，促進(jìn)其表達(dá)，可降低人乳頭瘤病毒引發(fā)宮頸癌的危險性[7]，因而推測miR-199b-5p可能參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的順鉑耐藥過程。透明質(zhì)酸蛋白聚糖連結(jié)蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1，HAPLN1)可調(diào)控腫瘤的耐藥性，是多發(fā)性骨髓瘤的一種致病因子，上調(diào)其表達(dá)，可促使多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對硼替佐米產(chǎn)生耐藥性；敲低HAPLN1的表達(dá)，可增強(qiáng)人大腸癌耐藥細(xì)胞株對甲氨蝶呤的敏感性，增強(qiáng)甲氨蝶呤導(dǎo)致的大腸癌細(xì)胞凋亡[8,9]，HAPLN1在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)，且受miR-199a-5p調(diào)控，并與患者的總體生存率顯著負(fù)相關(guān)[10]，但miR-199b-5p對宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥性和HAPLN1表達(dá)的調(diào)控作用，目前還未有研究，本文通過構(gòu)建人宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP，對此進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑：人宮頸癌細(xì)胞HeLa、MEM培養(yǎng)基、青鏈霉素溶液購買于武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CL-0101、PM150410、PB180120；順鉑(純度≥98%)購買于上海信裕生物科技有限公司，貨號XY24462；胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司，貨號10099-141、31985-070；LipofectamineTM2000、CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、總RNA提取試劑盒、一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII、高效RIPA裂解液購買于北京索萊寶科技有限公司，貨號11668-027、CA1210、PC0020、CA1050、R1200、T2240、SR1110、R0010；miR-199b-5p、U6、GAPDH、HAPLN1及多藥耐藥基因1(multidrug resistance 1，MDR1)引物、miR-199b-5p mimics陰性對照、miR-199b-5p mimics購買于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；羊抗兔二抗、兔源β-actin一抗、兔源P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)一抗、兔源HAPLN1一抗購買于美國Abcam公司，貨號ab150077、ab227387、ab170904、ab181997等。

1.1.2 主要儀器：酶標(biāo)儀購買于南京德鐵實驗設(shè)備有限公司，型號HBS-1096C；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司，型號CytoFLEX；DNA合成儀購買于中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，型號Dr.Oligo-192；熒光定量PCR儀購買于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號7900HT；小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購買于美國Bio-Rad公司，型號1658033；蛋白免疫印跡成像系統(tǒng)購買于美國Thermo Fisher Scientific公司，型號iBright等。

1.2 方法

1.2.1 建立人宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP并鑒定:復(fù)蘇購買的人宮頸癌細(xì)胞HeLa，經(jīng)5 ml完全培養(yǎng)液(MEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素)重懸后，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱(5%CO2、95%濕度)中培養(yǎng)，依次向培養(yǎng)液中加入濃度逐漸升高的順鉑，使HeLa細(xì)胞發(fā)生耐藥[11]，順鉑濃度從低到高依次為0.5、1、2、4、8、10、12、14、16、18、20 nmol/L，每個濃度培養(yǎng)1 d，活細(xì)胞傳代后，加入下1個更高的濃度繼續(xù)培養(yǎng)，直到HeLa細(xì)胞無明顯凋亡，穩(wěn)定生長，即得到人宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP。以CCK-8實驗鑒定HeLa/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥性：取處于對數(shù)生長期的HeLa和HeLa/DDP細(xì)胞，以胰酶消化、計數(shù)后，以1×105個/ml的密度分別接種在96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，24 h后以終濃度20 nmol/L的順鉑處理兩種細(xì)胞，每種細(xì)胞設(shè)6個孔作為重復(fù)，并選6個孔不接種細(xì)胞，只加培養(yǎng)液做空白對照，以不經(jīng)順鉑處理的HeLa細(xì)胞做對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，各孔中均加入CCK-8試劑，2 h后放入酶標(biāo)儀中混勻，于450 nm波長下測得各孔吸光度(optical density，OD)，計算2種細(xì)胞生存率，公式：生存率(%)=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.2.2 qRT-PCR檢測HeLa及HeLa/DDP中miR-199b-5p水平：取處于對數(shù)生長期的HeLa及HeLa/DDP細(xì)胞，以胰酶消化后，使用總RNA提取試劑盒，參照說明書的指導(dǎo)分別提取細(xì)胞中總RNA，配制qRT-PCR反應(yīng)體系預(yù)混液：取10 μl 2×SYBR Premix Ex TaqTMII、滅菌蒸餾水6 μl、ROX染料0.4 μl、上游引物0.8 μl、下游引物0.8 μl，加入反應(yīng)管中，此時取適量的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，參照說明書的指導(dǎo)制成cDNA后，再向反應(yīng)管中加入cDNA模板2 μl，混勻后放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件參照試劑說明書的指導(dǎo)設(shè)定，所得數(shù)據(jù)根據(jù)算法2-ΔΔCt進(jìn)行分析，選擇U6作為miR-199b-5p的內(nèi)參基因。

1.2.3 分組轉(zhuǎn)染處理細(xì)胞并收集標(biāo)本：取處于對數(shù)生長期的HeLa/DDP細(xì)胞，以胰酶消化后，接種在24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，24 h后隨機(jī)分為對照組、miR-199b-5p mimics組、順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組、順鉑+miR-199b-5p mimics組，參照說明書和文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染：將miR-199b-5p mimics、miR-199b-5p mimics陰性對照分別溶解在50 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，同時將2 μl LipofectamineTM2000溶解在100 μl Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中制成LipofectamineTM2000溶液，然后將miR-199b-5p mimics及miR-199b-5p mimics陰性對照溶液與50 μl LipofectamineTM2000溶液混勻、靜置，20 min后分組加入培養(yǎng)孔中處理細(xì)胞，此時棄去培養(yǎng)液，更換為Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，并向順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組、順鉑+miR-199b-5p mimics組培養(yǎng)孔中加入終濃度20 nmol/L的順鉑處理細(xì)胞，6 h后棄去Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，更換為完全培養(yǎng)液，同時再次加入順鉑，保持其終濃度不變，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，重復(fù)上述實驗操作3次，收集3份細(xì)胞。

1.2.4 檢測各組細(xì)胞增殖情況：取處于對數(shù)生長期的HeLa/DDP細(xì)胞，以胰酶消化、計數(shù)后，以1×105個/ml的密度接種在96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，24 h后參照1.2.3中步驟分組轉(zhuǎn)染并處理細(xì)胞，并參照1.2.1中CCK-8實驗步驟測定各組細(xì)胞生存率。

1.2.5 流式細(xì)胞實驗檢測各組細(xì)胞凋亡情況：取1份1.2.3中收集的各組細(xì)胞，通過PBS分別重懸，混勻后計數(shù)，根據(jù)結(jié)果取約1×106個細(xì)胞，將其細(xì)胞液放入離心機(jī)內(nèi)離心，5 min后加入PBS洗滌細(xì)胞，再次離心后，棄去上清，依次加入10 μl ArmexinV-FITC、500 μl Binding Buffer、5 μl PI，小心吹打均勻后，37℃避光孵育，15 min后離心，棄去上清，再次以PBS洗滌細(xì)胞后，加入200 μl PBS溶液，小心吹打均勻后，上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 qRT-PCR檢測各組細(xì)胞miR-199b-5p和HAPLN1、MDR1 mRNA水平：取1份1.2.3中收集的各組細(xì)胞，通過qRT-PCR實驗按照上述1.2.2的步驟檢測其中miR-199b-5p和HAPLN1、MDR1 mRNA水平，選擇U6作為miR-199b-5p的內(nèi)參基因，選擇GAPDH作為HAPLN1和MDR1的內(nèi)參基因。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.7 免疫印跡測定各組細(xì)胞HAPLN1和P-gp的蛋白表達(dá)：取1份1.2.3中收集的各組細(xì)胞，通過高效RIPA裂解液裂解細(xì)胞并離心，以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清中總蛋白濃度，具體操作參照各自說明書的指導(dǎo)進(jìn)行，將各組樣品液中蛋白濃度調(diào)至相同，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后通過濕轉(zhuǎn)將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，使用5%的低脂奶粉溶液37℃孵育2 h，封閉膜上蛋白的非特異性抗原，分別加入兔源β-actin一抗、兔源P-gp一抗、兔源HAPLN1一抗，4℃冰箱中孵育過夜，經(jīng)TBST洗膜3次，5 min/次，加入羊抗兔二抗，37℃搖床上緩緩搖動孵育2 h，經(jīng)TBST再次洗膜3次，5 min/次，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯色后采用蛋白免疫印跡成像系統(tǒng)拍攝圖片，最后以Image J軟件分析圖像并計算條帶灰度值，獲得各組目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 HeLa/DDP耐藥性鑒定結(jié)果 與對照組比較，HeLa細(xì)胞生存率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HeLa/DDP細(xì)胞生存率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2 miR-199b-5p在HeLa與HeLa/DDP中的表達(dá)結(jié)果 與HeLa細(xì)胞比較，miR-199b-5p在HeLa/DDP細(xì)胞中表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表3。

2.3 4組細(xì)胞生存率檢測結(jié)果 與對照組比較，順鉑+miR-199b-5p mimics組細(xì)胞生存率明顯降低(P<0.05)，miR-199b-5p mimics組、順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組細(xì)胞生存率無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與miR-199b-5p mimics組比較，順鉑+miR-199b-5p mimics組細(xì)胞生存率明顯降低(P<0.05)，順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組細(xì)胞生存率無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組比較，順鉑+miR-199b-5p mimics組細(xì)胞生存率明顯降低(P<0.05)。見表4。

表2 HeLa和HeLa/DDP細(xì)胞生存率比較

表3 Hela和Hela/DDP中miR-199b-5p水平的比較

表4 4組細(xì)胞生存率比較

2.4 4組細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果 與對照組比較，順鉑+miR-199b-5p mimics組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，miR-199b-5p mimics組、順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組細(xì)胞凋亡率無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與miR-199b-5p mimics組比較，順鉑+miR-199b-5p mimics組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組細(xì)胞凋亡率無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組比較，順鉑+miR-199b-5p mimics組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖1，表5。

圖1 4組細(xì)胞凋亡情況的流式細(xì)胞檢測結(jié)果；A 對照組；B miR-199b-5p mimics組；C 順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組；D 順鉑+miR-199b-5p mimics組

表5 4組細(xì)胞凋亡率比較

2.5 4組細(xì)胞miR-199b-5p及HAPLN1、MDR1 mRNA水平檢測結(jié)果 與對照組比較，順鉑+miR-199b-5p mimics組、miR-199b-5p mimics組miR-199b-5p明顯升高，HAPLN1、MDR1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)，順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組細(xì)胞HAPLN1、MDR1 mRNA水平無明顯改變(P>0.05)；與順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組比較，miR-199b-5p mimics組和順鉑+miR-199b-5p mimics組細(xì)胞miR-199b-5p明顯升高，HAPLN1、MDR1 mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 4組細(xì)胞miR-199b-5p及HAPLN1、MDR1 mRNA水平比較

2.6 4組細(xì)胞HAPLN1及P-gp蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果 與對照組比較，順鉑+miR-199b-5p mimics組、miR-199b-5p mimics組細(xì)胞HAPLN1、P-gp蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組細(xì)胞HAPLN1及P-gp蛋白表達(dá)水平無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組比較，miR-199b-5p mimics組和順鉑+miR-199b-5p mimics組細(xì)胞HAPLN1及P-gp蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖2，表7。

圖2 4組細(xì)胞HAPLN1及P-gp蛋白表達(dá)的免疫印跡檢測結(jié)果;A 對照組；B miR-199b-5p mimics組；C 順鉑+miR-199b-5p mimics陰性對照組；D 順鉑+miR-199b-5p mimics組

表7 4組細(xì)胞HAPLN1及P-gp蛋白相對表達(dá)比較

3 討論

宮頸癌作為臨床中婦科常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在女性中的發(fā)病率僅次于乳腺癌，是女性死于癌癥的主要原因[13,14]。順鉑是殺傷實體瘤的化療藥物，廣泛應(yīng)用在頭頸部惡性腫瘤、膀胱癌、卵巢癌和宮頸癌等多種腫瘤的臨床治療中，然而順鉑的長期使用易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的獲得性耐藥，是造成宮頸癌化療效果不佳的關(guān)鍵因素，因而闡明其耐藥機(jī)制并找到新的作用靶點對宮頸癌的治療意義重大[15,16]。

本文通過逐步增加人宮頸癌細(xì)胞HeLa培養(yǎng)液中順鉑濃度的方法構(gòu)建其順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HeLa/DDP在濃度為20 nmol/L的順鉑作用下，與未經(jīng)順鉑處理的HeLa細(xì)胞比較，生存率無明顯變化(100%)，無明顯凋亡發(fā)生，同時細(xì)胞的增殖情況良好、穩(wěn)定，表明人宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP構(gòu)建成功。

miR-199b-5p是一種微小RNA，可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及代謝等生理過程，在直腸癌、腎癌、甲狀腺癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生及病情進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-199b-5p高表達(dá)預(yù)示著晚期直腸癌患者放化療的療效較好[17]；腎細(xì)胞癌組織中miR-199b-5p的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，下調(diào)其表達(dá)，可促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖和遷移，同時降低其凋亡率[18]；miR-199b-5p還參與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的耐藥過程，促進(jìn)miR-199b-5p表達(dá)，能抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)其凋亡和對化療藥物紫杉醇的敏感性，還可減弱三陰乳腺癌細(xì)胞的移植瘤生長及順鉑耐藥性[7,19]。且有研究證實，miR-199b-5p參與調(diào)控宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[8]，但其對宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響，筆者發(fā)現(xiàn)，截至目前還沒有清楚闡釋。

本文通過qRT-PCR實驗測定人宮頸癌細(xì)胞HeLa和其順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP中miR-199b-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)比較HeLa細(xì)胞，miR-199b-5p在HeLa/DDP細(xì)胞中表達(dá)明顯降低，以miR-199b-5p mimics和順鉑聯(lián)合處理HeLa/DDP細(xì)胞，比較對照組和miR-199b-5p mimics組，可明顯降低細(xì)胞生存率，升高其凋亡率，表明miR-199b-5p mimics參與調(diào)控人宮頸癌細(xì)胞的順鉑耐藥過程，上調(diào)miR-199b-5p表達(dá)，可增強(qiáng)順鉑對耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP的殺傷力，增強(qiáng)人宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

MDR1是一種多藥耐藥基因，其轉(zhuǎn)移翻譯的蛋白產(chǎn)物P-gp作為一種能量依賴性的轉(zhuǎn)運蛋白，可將化合物逆向轉(zhuǎn)運出細(xì)胞，是調(diào)控腫瘤細(xì)胞多藥耐藥過程的主要蛋白[20]。研究表明，HAPLN1作為一種透明質(zhì)酸蛋白聚糖連結(jié)蛋白，可穩(wěn)定透明質(zhì)酸與腫瘤細(xì)胞表面受體的結(jié)合，繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成，NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在包括多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的許多血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的存活和增殖中起關(guān)鍵作用，HAPLN1可通過激活NF-κB通路，促使MM細(xì)胞對硼替佐米產(chǎn)生耐藥性，下調(diào)HAPLN1表達(dá)水平，可抑制IKK/NF-κB p65信號活化，進(jìn)而增強(qiáng)甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)對人大腸癌耐藥細(xì)胞株HT-29/MTX的敏感性，提高其殺傷作用，提示HAPLN1在腫瘤的耐藥性獲得過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[9,10]，有可能是miR-199b-5p減輕人宮頸癌細(xì)胞對順鉑耐藥性的作用靶點。

本文研究結(jié)果顯示，以miR-199b-5p mimics處理HeLa/DDP細(xì)胞，與對照組比較，可明顯降低細(xì)胞HAPLN1及MDR1 mRNA水平、HAPLN1及P-gp蛋白表達(dá)水平，并明顯升高miR-199b-5p表達(dá)；以miR-199b-5p mimics和順鉑聯(lián)合處理HeLa/DDP細(xì)胞，與對照組比較，不僅可明顯降低細(xì)胞HAPLN1及MDR1 mRNA水平、HAPLN1及P-gp蛋白表達(dá)水平，還可明顯降低細(xì)胞生存率，并升高其凋亡率和miR-199b-5p表達(dá)；以miR-199b-5p mimics和順鉑聯(lián)合處理HeLa/DDP細(xì)胞，與miR-199b-5p mimics組比較，僅可明顯降低細(xì)胞生存率，并明顯升高其凋亡率，而不改變miR-199b-5p、HAPLN1及MDR1 mRNA水平、HAPLN1及P-gp蛋白表達(dá)水平，表明上調(diào)miR-199b-5p表達(dá)，可下調(diào)HAPLN1和耐藥基因MDR1的表達(dá)，提高人宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，減輕其耐藥性，進(jìn)而促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，miR-199b-5p在人宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP中表達(dá)明顯降低，促進(jìn)miR-199b-5p表達(dá)，可下調(diào)HAPLN1、耐藥基因MDR1和其蛋白產(chǎn)物P-gp的表達(dá)，增強(qiáng)HeLa/DDP對順鉑的化療敏感性，抑制其增殖，并促進(jìn)其凋亡，表明miR-199b-5p是緩解宮頸癌化療耐藥的作用靶點之一，調(diào)控HAPLN1表達(dá)可能是其分子機(jī)制。