真武湯治療肝癌腹水的網絡藥理學研究

劉秋月，洪曉華，滿婷婷，榮震

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530000；2.寶安純中醫治療醫院，廣東 深圳 518101）

0 引言

原發性肝癌(Primary liver cancer,PLC)，簡稱肝癌，源于肝細胞、肝內膽管上皮細胞的惡性疾病。2020全球癌癥統計報告[1]指出，肝癌已超越胃癌，位列世界癌癥死亡的第三。肝癌發病具有隱匿性，絕大部分肝癌患者確診時已屬中或晚期。其中晚期肝癌患者最常見的失代償事件是腹水，腹水的發生與肝癌患者的低生活質量和高死亡率具有相關性[2]。當前，現代醫學對肝癌腹水的規范化治療以利尿、引流、保肝和抗腫瘤為主，但療效欠佳且缺乏個體化治療[3]。多項研究證實中醫藥聯合西醫治療肝癌腹水在改善患者腰圍、癥狀和提高生活質量、免疫功能以及延長生存時間等方面優勢顯著[4-7]。因此，研究具有多靶點、多通路為特點的中藥處方，可讓更多的肝癌腹水患者臨床獲益，改善情況。肝癌腹水根據其臨床癥狀，可歸“鼓脹”“蜘蛛蠱”一屬。中醫認為肝病日久，木克脾土致脾失健運，加之病延及腎，肝腎陰虛，陽不化水，水聚于腹中是其病機[8]。故治當以回陽保陰，健脾制水之劑。由國家中醫藥管理局評為第一批古代經典名方的真武湯出自漢代仲景·《傷寒論》，可用以辨治少陰陽虛、水氣泛溢者，全方由附子、茯苓、芍藥、白術、生姜五藥組成，共奏溫陽、固土、制水之功。真武湯的功效正切肝癌腹水的病機，于臨床應用治療肝癌腹水療效較好[10,11]。但目前對于真武湯治療肝癌腹水的作用機制尚不明確，為闡明該方治療肝癌腹水的作用機制，借助可從多角度展現中藥處方治療疾病作用機制的網絡藥理學，探析真武湯治療肝癌腹水的作用機制，以期為肝癌腹水的臨床治療與實驗研究提供科學思路和依據。

1 方法

1.1 真武湯中藥物成分及靶點收集

基于TCMSP（https://tcmsp-e.com/）數據庫，根據OB≥30%，DL≥0.18為條件，篩選得到真武湯中5味藥物的有效化學成分，同時利用DrugBank（http://www.drugbank.ca/）數據庫確認經TCMSP數據庫篩選得出的真武湯有效化學成分所對應的有效作用靶點。而后于Uniprot（http://www.uniprot.org/）數據庫中錄入經剔除相同靶點后所得的化學成分-靶點，以“Homo sapiens”條件進一步剔除非人源及重復的靶點，校正得到真武湯有效化學成分的基因靶點（Gene symbol）。

1.2 肝癌腹水靶點的獲取及PPI構建

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫以“Cancer of the liver ascites”為關鍵詞，搜集肝癌腹水相關的疾病靶點，將真武湯靶點與肝癌腹水靶點使用Venny在線分析軟件構建韋恩圖，從而獲取藥物與疾病的交集靶點，通過STRING平臺分析PPI網絡相關信息，借助Cytoscape軟件（3.7.2版）構建PPI網絡，并通過Cytoscape 軟件（3.7.2版）構建真武湯與肝癌腹水的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡。

1.3 GO功能與KEGG通路的富集分析

通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）數據庫對真武湯作用于肝癌腹水的靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，通過獲得的生物學信息分析真武湯治療肝癌腹水可能的作用機制，并將GO功能和KEGG通路的富集結果以可視化形式呈現。

2 結果

2.1 真武湯有效化學成分

使用TCMSP數據庫挖掘，根據條件篩選后得到真武湯有效化學成分共83個，其中附子21個，茯苓15個，芍藥35個，白術7個，生姜5個，真武湯部分有效化學成分見表1。

表1 真武湯部分有效化學成分表

2.2 真武湯對肝癌腹水的作用靶點

于TCMSP數據庫中根據條件篩選并去重后所獲得的真武湯83個有效化學成分，通過Uniprot數據庫確定其對應的93個靶點，同時肝癌腹水的649個靶點由GeneCards數據庫獲得，而后使用Venny在線分析軟件繪制韋恩圖（見圖1），獲得真武湯與肝癌腹水的交集靶點26個，包含有IL6、VEGFA、TP53、PTGS2和MMP9等，即真武湯治療肝癌腹水相關作用機制的26個作用靶點。

圖1 真武湯與肝癌腹水的韋恩圖

2.3 真武湯與肝癌腹水的PPI網絡及“藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建

將26個真武湯與肝癌交集靶點導入至STRING數據庫平臺，經分析得到PPI網絡的節點數為26個，邊數有134條，平均節點度是10.3，將所得結果導出，借助Cytoscape軟件（3.7.2版）構建PPI網絡（圖2），同時篩選度值≥2倍平均節點度的關鍵靶點，最終獲得兩個關鍵靶點，分別是IL6和VEGFA；并通過Cytoscape 軟件（3.7.2版）構建真武湯與肝癌腹水的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡（圖3）。

圖2 真武湯與肝癌腹水的PPI網絡圖

圖3 真武湯與肝癌腹水的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖

2.4 GO功能富集分析

使用D AVID數據庫對真武湯治療肝癌腹水的26個作用靶點進行GO功能富集分析，得到生物學過程（Biological process,BP）130條，細胞組分（Cellular component,CC）17條，分子功能（Molecular function,MF）36條，其中BP、CC和MF的PValue值前10的見圖4。

圖4 真武湯治療肝癌腹水作用靶點的GO功能分析

2.5 KEGG通路富集分析

將真武湯治療肝癌腹水的26個作用靶點輸入DAVID數據庫進行KEGG通路富集分析，獲得30條通路，依據PValue值小于0.05為截止值，篩選得到23條通路（表2），并行可視化分析，繪制氣泡圖（圖5），氣泡形狀展現的越大，表示富集基因個數越多；氣泡顏色展現的越綠，表示PValue值越小，顯著性越高。圖中主要涉及的信號通路有NF-kappa B信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路等。

圖5 真武湯治療肝癌腹水作用靶點的KEGG通路分析

3 討論

3.1 真武湯治療肝癌腹水研究基礎

肝癌腹水于晚期肝癌患者中常見[12]，“見肝病，知傳脾”[13]，水運失司，則水濕停滯；患者病久延及少陰（腎），氣化不行，則水氣泛濫。真武湯之名“真武”，主鎮少陰水氣，功在以土制水，可溫腎陽、固脾土、治水邪，陽化土固，水邪自消。藥物雖只五味，但契合肝癌腹水的中醫病機，效力甚佳。多名研究者發現真武湯能夠有效治療肝癌腹水。鮑文菁[4]研究發現真武湯能夠較快的改善肝癌腹水情況，患者生存質量較前質優。牛紅星[10]使用真武湯治療肝癌患者30天后，觀察發現患者腹水消退時間縮短，同時具有維持機體電解質平衡的作用。

3.2 真武湯成分分析

網絡藥理學研究得出真武湯具有多種化學成分，其治療肝癌腹水的關鍵成分（OB＞80%）有Paeoniflorigenone（芍藥苷）、I gnavine（惰堿）和(R)-Norcoclaurine（(R)-去甲烏藥堿）。Huang Y等[14]研究表明芍藥苷為單帖類物，具有細胞毒性，芍藥苷可誘導腫瘤選擇性凋亡，其主要提高了caspase-3對腫瘤細胞的活性；但研究亦發現芍藥苷雖可誘導腫瘤凋亡，但并未誘導正常細胞凋亡，對正常細胞具有低細胞毒性。Lu JT等[15]研究顯示芍藥苷能減少肝癌細胞的侵襲、黏附和轉移，Liu H團隊[16]的研究結果與Lu JT等[15]研究一致，且發現芍藥苷可抑制肝癌細胞Skp2的表達，其抑制肝癌HepG2細胞的遷移和侵襲是通過抑制細胞活力。惰堿[17]為一種低毒生物堿，具有一定的利尿作用。去甲烏藥堿在該方中顯現出高活性，宋莉等[18]研究表明去甲烏藥堿誘腫瘤凋亡，抑制其生長。以上研究表明真武湯能通過多成分治療肝癌腹水。

3.3 主要作用靶點分析

經分析真武湯治療肝癌腹水的作用靶點，可得出26個作用靶點，包含有IL-6、VEGFA、TP53、PTGS2和MMP9等，其中IL-6和VEGFA為關鍵靶點。IL-6是一種多效細胞因子，高表達于肝癌組織中，具有增強腫瘤細胞活性的作用，同時其可通過聚集抗免疫抑制細胞起到強免疫抑制的作用[19,20]。此外，IL-6為抗腫瘤凋亡誘導劑，十分契合肝癌各階段（起始-促動-進展）伴有細胞凋亡的特性，其可為肝癌的發生發展助力。研究表明[21,22]阻斷IL-6能實現抑制肝癌細胞生長轉移和促肝癌凋亡的作用。VEGFA（血管內皮生長因子A）在各癌癥中普遍存在，為腫瘤新生血管的重要調控因子，還與腫瘤進展密切相關，如增殖、侵襲等[23]。岳倫莉[24]發現肝癌中VEGFA的高表達，具有逆轉miR-195-5p的作用，激活肝癌細胞的發展。

3.4 主要通路分析

KEGG通路分析顯示真武湯治療肝癌腹水的26個作用靶點主要參與NF-kappa B信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路等信號通路。肝癌的發生與乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）慢性感染相關，可由其誘導產生和發展。汪靜雯[25]研究發現NF-kappa B信號通路可被HBV通過miR-192-3p來激活，增加其病毒復制，可能與肝癌的發生有關。NF-kappa B受相關刺激后會影響肝癌細胞，使其激活IKK并磷酸化IKB，進而將下游靶分子激活，引起炎性反應及腫瘤新生血管的產生與侵襲。該通路所調控的既包含有強促血管因子VEGF，亦有促侵襲轉移因子MMP9。朱倩等[26]研究證實NF-kappa B信號通路由活化后，肝癌細胞中的VEGF及MMP9表達會提高，肝癌細胞的侵襲能力增強，使用NF-kappa B抑制劑（BAY11-7082）后可抑制其侵襲力。HIF1α在肝癌缺氧狀況下高表達，對肝癌細胞多方面有促進作用（如增殖、遷移、血管新生等）。程偉[27]研究證實天冬化合物（天冬多糖）可通過HIF1α/VEGF信號通路抑制肝癌細胞的發展和腫瘤血管的新生。

3.5 小結與展望

本研究通過網絡藥理學研究真武湯治療肝癌腹水的潛在作用機制，從研究結果發現真武湯治療肝癌腹水是通過Paeoniflorigenone（芍藥苷）、Ignavine（惰堿）和(R)-Norcoclaurine（(R)-去甲烏藥堿）等多種成分作用于IL-6、VEGFA、TP53、PTGS2和MMP9等多個基因靶點，從而通過NF-kappa B信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路等多通路發揮功效，通過抑制肝癌的發展而減少腹水的生成。本研究為真武湯治療肝癌腹水的后續基礎研究提供了一定的理論基礎，但因網絡藥理學僅通過網絡數據庫及軟件的分析預測，未能綜合考慮中藥各化學成分析出是否進一步相互結合產生新化合物及各藥物是否會因藥量變化而改變，故本研究的結果仍需進一步的驗證。