纈草藥材質量標準提升研究

國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550026

纈草為敗醬科植物纈草ValerianaofficnalisL.及寬葉纈草ValerianaofficnalisL.var.latfolia Miq.的干燥根及根莖，秋季采挖，除去雜質，陰干，為《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》[1]收錄的貴州省少數民族用藥，具有理氣止痛、祛風除濕、寧心安神的功效，用于脘腹脹痛、風濕痹痛、腰膝酸軟、失眠等。纈草分布于我國東北至西南的廣大地區(qū)。生于海拔2500 m以下山坡草地、林下、溝邊，在西藏可分布至海拔4000 m[2]。寬葉纈草分布于安徽、江蘇、浙江、江西等省區(qū)，貴州主要分布于松桃、印江、沿河、劍河、鎮(zhèn)寧、岑鞏、道真、綏陽、湄潭、凱里、正安、桐梓等地。纈草主要含環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油、生物堿、木脂類、黃酮類、氨基酸等化學成分[3-6]，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗驚厥和癲癇等藥理作用[7-14]。在歐美作為一種溫和的鎮(zhèn)靜安神催眠藥使用[13]。但國內纈草藥材質量控制方面的研究較少[14]，現行質量標準僅收載性狀、鑒別項。因此，貴州省藥品監(jiān)督管理局將纈草納入《貴州省中藥材、民族藥材質量標準研究》計劃，筆者改進薄層色譜鑒別方法，增加水分、總灰分、浸出物檢查，采用氣相色譜法測定乙酸龍腦酯含量，為質量標準修訂提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 GC-14C型氣相色譜儀(島津)；SB25-12DTS型數控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；CX41型顯微鏡(OLYMPUSCORPORATION)； Scopelmage 9.0 圖像采集軟件(寧波永新光學股份有限公司)； E201型紫外可見分光光度計(Thermo)、ML204電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)、純水儀(Genie-5 Rephile)。

1.2 材料 乙醇(批號：20170901)、無水乙醇(批號：20170201)購自重慶川東化工(集團)有限公司；乙酸龍腦酯對照品(110759-201105)、水楊酸甲酯對照品(110707-201413)購自中國食品藥品檢定研究院。水為自制純化水。 10 批纈草(編號S1～S10)由國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司種植部提供，經貴州中醫(yī)藥大學藥學院何順志教授鑒定為敗醬科植物纈草ValerianaofficnalisL.及寬葉纈草ValerianaofficnalisL.var.latfolia Miq.的干燥根及根莖。具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 水分含量測定 精密稱取10批纈草藥材粉末(過二號篩)約20 g，按照2020年版《中國藥典》[15](四部)通則“0832水分測定法”的第四法(甲苯法)進行測定，每批樣品平行測定兩份，取平均值。結果，10批樣品中水分的含量最低為9.81%，最高為13.60%，平均值為11.18%，以平均測定值的120%設限，為13.42%，故建議將水分標準定為不得過13.00%。纈草藥材水分含量測定結果見表2。

2.2 總灰分含量測定 精密稱取10批纈草藥材粉末(過二號篩)各約2.5 g，按照2020年版《中國藥典》[15](四部)通則“2302灰分測定法”的第一法(總灰分測定法)進行測定，每批樣品平行測定兩份，取平均值。結果，10批樣品中總灰分的含量最低為9.81%，最高為11.77%，平均值為10.94%，以平均測定值的120%設限，為13.13%，故建議將總灰分標準定為不得過13.00%。纈草藥材總灰分含量測定結果見表2。

2.3 浸出物含量測定 取10批纈草藥材粉末(過二號篩)各約3 g，按照《中國藥典》[15]2020年版四部通則2201醇溶性浸出物測定法項下熱浸法測定，用50%乙醇作溶劑，每批樣品平行測定兩份，取平均值。結果，10批樣品中浸出物最低值為17.5%，最高值為21.2%，平均值為19.75%，以平均值的80%設限，為15.8%，故建議將浸出標準定為不得少于16.0%。纈草藥材浸出物含量測定結果見表2。

表2 纈草水分測定結果

2.4 乙酸龍腦酯含量測定

2.4.1 校正因子測定 精密稱取水楊酸甲酯對照品適量，加無水乙醇制成每1 mL含2.8 mg的溶液，搖勻，作為內標儲備溶液。另取乙酸龍腦酯對照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作為對照儲備液。精密吸取 5 mL 置50 mL量瓶中，精密加入內標儲備液5 mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1 μL，注入氣相色譜儀，測定，計算校正因子。

2.4.2 內標溶液制備 精密吸取5 mL內標儲備液置50 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度[16-17]，即得內標溶液。

2.4.3 供試品溶液制備 取供試品約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加75%乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液2 mL與內標溶液2 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2.4.4 色譜條件 以聚乙二醇20000(PEG-20M)為固定液的毛細管柱(柱長為30 m，內徑為320 μm，膜厚度為0.5 μm)為色譜柱。載氣為高純度氮氣(純度>99.999%)，流速 0.8 mL/min；柱溫為140 ℃；進樣口溫度為 200 ℃；FID檢測器，檢測器溫度為250 ℃；分流進樣，進樣量1 μL，分流比為10∶1。理論板數按乙酸龍腦酯峰計算應不低于2000。色譜圖如圖1所示。

圖1 纈草氣相色譜圖

2.4.5 線性關系 精密稱取水楊酸甲酯對照品適量，加無水乙醇制成每1 mL含2.8084 mg的溶液，搖勻，作為內標儲備溶液。另取乙酸龍腦酯對照品適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1 mL含 1.2167 mg 的對照品儲備溶液。分別精密吸取乙酸龍腦酯對照品儲備溶液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、10 mL、15 mL于 25 mL 量瓶中，并分別精密加入內標儲備溶液 2 mL，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1 mL中含48.668 μg、97.336 μg、146.004 μg、243.340 μg、486.680 μg、730.020 μg的系列對照品溶液，依次吸取1 μL，注入氣相色譜儀，按“2.4.4色譜條件”項下方法測定峰面積。以峰面積為縱坐標、乙酸龍腦酯對照品進樣量為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為：Y=0.4493X+1.0979(R2=1.0000)，表明乙酸龍腦酯在48.668～730.020 μg/mL范圍內與其峰面積呈良好的線性關系。

2.4.6 精密度試驗 精密吸取乙酸龍腦酯(97.336 μg/mL)對照品溶液， 按“2.4.4” 項色譜條件連續(xù)進樣測定6次， 記錄色譜峰面積。結果乙酸龍腦酯峰面積的RSD為0.40%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復性試驗 精密稱取已知含量的同一批號的樣品6份(S4)，每份約1.5 g，按“2.4.3” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.4.4”項色譜條件下進樣測定，6次乙酸龍腦酯峰面積的RSD為1.88%，表明該方法重復性良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.7 重復性試驗”制備的供試品溶液，按“2.4.4項下色譜條件”，分別于1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h測定乙酸龍腦酯峰面積。結果表明，乙酸龍腦酯面積的RSD為1.36%，表明乙酸龍腦酯溶液在室溫下6 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量樣品(S4，含量為0.180%)，混勻，取6份，每份約0.75 g，置25 mL具塞錐形瓶中，每份分別精密加入乙酸龍腦酯對照品溶液1 mL(1.2167 mg/mL)，按“2.4.3”供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，在“2.4.4”項色譜條件進樣測定，計算乙酸龍腦酯回收率，乙酸龍腦酯平均回收率為99.16%，RSD=0.46%，表明方法的準確度較好。結果見表3。

2.4.10 樣品含量測定 取10批纈草藥材，按“2.4.3”供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.4.4”項下色譜條件進行測定乙酸龍腦酯含量，結果見表4。

表3 加樣回收率實驗結果

表4 不同批次纈草含量限度測定

根據測定結果，10批纈草藥材含量范圍為：1.35～2.06 mg/g，平均值為1.84 mg/g，最低值為1.35 mg/g，最高值為2.06 mg/g，以平均值的80%設限，為1.47 mg/g，考慮到各種藥材原料含量的波動，故建議將纈草中乙酸龍腦酯含量限度標準暫定為不得少于1.5 mg/g。

3 討論

3.1 供試品溶液制備 根據化學成分的溶解性，分別對提取溶劑(甲醇、乙醇、乙酸乙酯)，提取溶劑濃度(25%、50%、75%、95%)，提取方法(超聲、回流)，提取溶劑用量(15 mL、25 mL、35 mL)，提取時間(20 min、30 min、40 min)，樣品取樣量(1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g)等條件進行考察，結果表明，以本文中制備方法制備的供試品溶液峰面積最大。

3.2 色譜條件 分別選擇對進樣口溫度(195 ℃、200 ℃、205 ℃)，檢測器溫度(245 ℃、250 ℃、255 ℃)，柱溫(135 ℃、140 ℃、145 ℃)，流速(0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min)，分流比(5∶1、8∶1、10∶1、15∶1)及不同廠牌(Thermo和Agilent)進行耐用性試驗考察。結果表明，按照本文確定的色譜條件進行試驗，在不同的進樣口溫度、不同的檢測器溫度、不同的柱溫及不同廠牌的色譜柱的小范圍變動情況下測定結果穩(wěn)定，重現性好，表明本試驗建立的方法耐用性強。

3.3 浸出物測定方法考察 在進行浸出物測定時，對浸出物測定方法(冷浸法、熱浸法)，浸出溶劑種類(乙醇、甲醇、水)，浸出溶劑(乙醇)濃度(25%，50%，75%，95%)進行考察，結果，使用本文的浸出方法和溶劑濃度測定時，浸出物含量最高。

3.4 藥材基原確定 寬葉纈草為貴州省苗族習用藥材，是敗醬科植物纈草的一個變種， 2003版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》以寬葉纈草為藥材名，僅收載纈草變種寬葉纈草，根據對貴州民間走訪和對纈草資源的調查以及原植物鑒定，貴州民間將纈草和寬葉纈草同時作為藥用，且均稱呼為纈草。而且經查閱《科學的民間藥草》《植物學大辭典》《全國中草藥匯編》《中華本草》《陜西中草藥》等本草專著，均將寬葉纈草和纈草列為藥材纈草的原植物，故本次標準修訂將2003版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》原藥材名寬葉纈草更名為纈草，將植物纈草ValerianaofficnalisL.作為藥材纈草的來源之一。

3.5 指標成分選擇 纈草中含揮發(fā)油0.5%～2%，揮發(fā)油中乙酸龍腦酯含量一般超過30%，有的寬葉纈草中乙酸龍腦酯甚至高達60%[18]，且纈草揮發(fā)油藥理作用顯著，應用前景廣闊，故選擇纈草中含量高且藥理作用顯著的乙酸龍腦酯作為質量控制的指標性成分。

綜上，研究增加纈草藥材質量標準中水分、灰分、浸出物限度檢查，采用氣相色譜法測定纈草中乙酸龍腦酯含量，完善纈草藥材質量控標準，所建立的檢查限度合理，含量測定方法專屬性較強，精密度較高，重復性較好，可為纈草藥材質量標準修訂提供參考。