蠟樣芽孢桿菌引起的食源性疾病檢測方法研究*

曹 霞，巴瑩瑩，王燕華

(重慶市南川區疾病預防控制中心，重慶 408400)

食源性疾病是當前世界上最突出的衛生問題之一。根據國家食品安全風險評估中心監測數據顯示，僅2021年我國食源性疾病暴發事件達5 493起，發病32 334例。其中，由微生物導致的食源性疾病位居第二。在事件處置過程中，通過對病例生物樣本、食品、環境等樣品的檢測和流行病學調查結果相關性分析，確定食物鏈及食品衛生學特征，對控制食源性疾病的暴發流行起到非常重要的作用。而傳統的病原體培養檢測周期長，對樣品檢測人員技術要求高，限制了食源性疾病病例與食物鏈的同時收集、同步快速有效檢測，不利于證據鎖定[1]。本文通過多重聚合酶鏈反應(PCR)分子生物學技術、飛行時間質譜技術，與傳統致病菌培養相結合的方法，快速鎖定突發公共衛生事件中檢測方向，旨在為食源性疾病的病原檢測找到更為快捷、有效的方法，提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1基本情況 2022年6月8日19:00，南川疾控中心接到區人民醫院電話報告：當晚接診3例(一家人)因惡心、嘔吐等癥狀到該院急診科就診的病例，因有共同就餐史，懷疑為食用不潔食物引起的食物中毒。經情況核實及流行病學調查，此次事件陸續涉及8個家庭18例病例，均食用了在同一攤位購買的米粉，患者發病潛伏期短(30 min至3 h)，臨床表現以惡心、嘔吐、頭暈為主，后期部分病例出現腹痛、腹瀉等癥狀，符合食源性疾病表現。

1.1.2樣品來源 工作人員陸續采集患者嘔吐物、未食用完米粉、加工店剩余米粉及現場環境樣品等共計18份。

1.2方法

1.2.1主要儀器和試劑 MALDI Biotyper時間飛行質譜儀(德國Bruker公司)；FilmArray 2.0多重病原體分子檢測系統(法國生物梅里埃公司)；VTEK-2細菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)；PCR擴增儀(美國伯樂公司)；恒溫培養箱(德國 Memert公司)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

食物中毒(18種)多重核酸快速檢測試劑盒(熒光PCR法)(深圳生科原生物有限公司)；胃腸道感染性病原體核酸聯合檢測試劑盒(法國生物梅里埃公司)；BCL卡；蠟樣芽孢桿菌ATCC14579；甘露醇多黏菌素培養基(MYP)、硫酸錳培養基、營養瓊脂等。

1.2.2多病原及多重實時熒光PCR篩查 多病原篩查是將每份標本分別吸取 200 μL樣本加入樣本制備管內，合上管蓋，上下顛倒3次以混勻，按儀器標準操作流程在1 h內完成包括核酸提取、純化、逆轉錄、第一輪 PCR 擴增、第二輪 PCR 擴增在內的多個反應步驟，并得到測試條中22種常見胃腸道感染相關的病原體靶標(包括13種細菌、4 種寄生蟲和 5 種病毒所有病原體靶標)檢測結果。多重核酸快速檢測則是將糞便、食品、嘔吐物樣本及增菌液參照核酸提取試劑盒說明書(RNA 提取試劑盒)，以提取的核酸為模板，分別進行沙門氏菌、志賀氏菌、結腸彎曲菌、空腸彎曲菌、 單增李斯特氏菌、大腸桿菌 0157、蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌 bfp 基因和 escV 基因、小腸耶爾森菌、肉毒桿菌、變形桿菌、產氣莢膜桿菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、腸道腺病毒等病原實時熒光PCR檢測。

1.2.3蠟樣芽孢桿菌定性定量培養 稱取25 g可疑食品，放入盛有225 mL生理鹽水溶液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器充分混勻后進行5個稀釋度稀釋，用無菌L棒將稀釋液均勻涂布接種于MYP平板，靜置10 min,30 ℃培養24 h后進行蠟樣芽孢桿菌平板計數。取10 μL糞便標本，劃線接種于MYP平板，進行蠟樣芽孢桿菌定性培養。環境涂抹樣，患者嘔吐物及肛拭子均參照GB4789進行。

1.2.4MALDI Biotyper時間飛行質譜(Bruker)檢測 從MYP平板上挑取可疑菌落轉普通營養瓊脂進行純化，根據布魯克微生物快速鑒定系統操作規程，采用直接轉移法制備待檢樣本。用一次性接種環挑取受試菌株單個菌落，直接涂抹于不銹鋼 MALDI MSP靶板圓孔中，每孔滴加70%甲酸溶液1 μL,室溫下晾干。隨后用1 μL基質溶液覆蓋，自然晾干后上機鑒定。結果用 Biotyper3.1 Database 處理分析。

2 結 果

2.1多病原檢測系統篩查結果 FilmArray多病原篩查13種細菌，4種寄生蟲和5種病毒。包括彎曲菌(空腸、結腸、烏普薩拉)、難辨梭菌(霉素A/B)、類志賀鄰單胞菌、沙門菌、弧菌(副溶血、創傷、霍亂)、霍亂弧菌、小腸結腸耶爾森菌、致瀉大腸埃希菌/志賀菌、腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)、產腸毒素大腸埃希菌(ETEC)、腸致病性大腸埃細菌(EPEC)、產類志賀毒素大腸埃希菌(STEC)、大腸埃希菌0157、志賀菌/腸侵入性大腸埃希菌(EIEC)、隱孢子蟲、環孢子蟲、痢疾阿米巴、蘭伯氏賈第鞭毛蟲、腺病毒F組40/41、星狀病毒、諾如病毒GI/GⅡ、輪狀病毒A群、扎如病毒(Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ)。檢測結果均為陰性。

2.2多重PCR核酸快速檢測結果 11個樣品中檢出蠟樣芽孢桿菌核酸陽性10個。陽性樣品包括食品樣品3個，物表拭子2個，患者嘔吐物及糞便5個。檢測結果見表1。

表1 可疑污染樣品多重PCR核酸檢測結果

2.3蠟樣芽孢桿菌定量及定性培養 18個樣品中有9個樣品分離出蠟樣芽孢桿菌，其中5件為食品樣品(兩份剩余米粉蠟樣芽孢桿菌菌落計數高達2.1×106、1.1×106CFU/g)。其余4件為環境樣及物表拭子。3個樣品檢出金黃色葡萄球菌。檢測結果見表2。

表2 可疑污染樣品細菌培養結果[n(%)]

2.4MALDI Biotyper時間飛行質譜(Bruker)鑒定結果 在食品及物表拭子中分離純化培養的61株可疑菌株，經Bruker MBT_DB5989 數據庫分析,譜圖的相合性以0～3之間的數值[“log (分值)”=分值]形式表示。置信水平以log(分值)≥2.0獲得可能鑒定[2]。經質譜鑒定為蠟樣芽孢桿菌的有37株，金黃色葡萄球菌2株，score評分均在1.89～2.40分，未成功鑒定的有22株，鑒定率為63.9%。質譜陽性菌株鑒定結果與 VITEK-2 及血漿凝固酶鑒定結果一致。檢測結果見表3。

表3 MALDI Biotyper時間飛行質譜儀(Bruker)鑒定結果匯總

3 討 論

3.1多重PCR等快速檢測方法的技術優勢 根據《食源性疾病暴發：調查和控制指南》[3]及重慶市食源性疾病突發事件衛生應急處置技術規范(試行)，檢驗人員接到食源性疾病突發樣品后，應作為緊急情況立即進行檢驗，以最快速度出具檢驗報告。根據國家衛生健康委員會《食品衛生監督程序》的規定，一般應在5 d內出具檢驗報告。傳統的生物培養鑒定法不僅需要增菌，選擇性平板培養，可疑菌落分純及生化鑒定，血清學鑒定多個步驟，更重要的是在事件暴發初期就必須確定正確的檢測方向，這對流調人員現場流行病學調查結果相關性分析，掌握重要微生物、理化及毒素等病因導致食源性疾病的臨床表現、標本采樣要求及判定標準的要求很高，一旦檢測方向錯誤，付出的時間及人力、物力成本極大。就此次事件而言，即使是目標明確的常規培養時間耗費也在5 d以上，此外，在食源性疾病暴發檢測中，受制于樣品采集環節的局限(如某些食品樣品缺失，樣品量不夠等)，特別是某些條件致病菌導致的食源性疾病，還涉及菌落計數及毒素分型的鑒定，檢測方法與常規GB4789標準程序也有較大的不同，結果報告時間亦無法保證。

本次食源性事件處置過程中，實驗室利用FilmArray 全自動醫用 PCR 分析系統及多重核酸快速檢測試劑盒在無須復雜樣本前處理的情況下一次性檢測20多種相關的病原體靶點，從食品、環境及人員3個方面快速鎖定檢測方向，在事件發生初期，11個樣品中即檢出蠟樣芽孢桿菌核酸陽性樣品10個，涉及食品樣品、物表拭子、患者嘔吐物及糞便，基本覆蓋了完整的食物中毒鏈條。基于上述實驗室病原檢測結果，4 h內基本可以判斷蠟樣芽孢桿菌污染極有可能是此次急性胃腸炎暴發的原因之一，這與后期細菌培養結果基本一致(尤其是兩件食品中蠟樣芽孢桿菌平板計數值超過1.0×105CFU/g的中毒劑量)；而MALDI-TOF MS 技術的運用，在可疑菌株的鑒定方面具有快速、高效、檢測成本低廉的優勢，菌落分純上機后5 min內便可在參考數據庫內鑒定到屬或種的水平，應急狀態下替代傳統生化鑒定和血清學鑒定技術，也為爭取疫情快速處置時間發揮了重要作用。這些快速檢測方法和自動化檢測技術，不僅順應了食品監管對應急事件處置時間的要求[4]，而且操作便捷，是傳統培養技術逐步向分子檢測水平發展的一個方向。

3.2應用缺陷 盡管實時熒光PCR、時間質譜等方法為事件準確定性提供了良好的檢測平臺，但實際應用中仍存在不少缺陷,除了受被檢樣品在采集、運輸、儲存及核酸提取過程中DNA 降解，患者或帶菌者服用抗生素或其他抑菌制劑等影響外，方法檢出限、抗干擾能力、交叉反應等都可能造成檢測結果與國標經典方法出現偏差[5-6]。此次食源性疾病檢測過程中，FilmArray多病原檢測系統和多重核酸快速檢測試劑均未能檢測出患者嘔吐物中的金黃色葡萄球菌。這除了可能與樣品前期增菌時間不足，細菌濃度較低有關；還可能與試劑檢測下限較高(>1 000 copies)等因素有關。并且上述兩種方法一次性檢測成本消耗均較大,也在一定程度上限制了其在常規檢測中的應用。

在此次突發事件中，食品及物表拭子中分離純化培養的61株可疑菌株，MALDI-TOF MS初次鑒定率準確率僅為63.9%。除了對可疑菌株的識別存在偏差外，檢測實踐過程中，不同的實驗室人員在同一株菌樣品涂抹處理上前后鑒定結果也呈現出較大的差異，這與鮑春梅等[7]利用 MALDI-TOF MS技術分析直接涂抹法及提取法對宋內志賀菌的鑒定情況有類似之處。菌膜涂布太薄或太厚、忘記添加基質、基質結晶不均勻等情況都會干擾鑒定結果。不僅如此，樣品制備完成進靶后，儀器真空度大小、質量軸偏移、激光能量Offset值設置太強或太弱會都會影響圖譜質量。此外，這項技術最大的局限性在于數據庫[8-9]。MALDI-TOF MS難以鑒定參考數據庫中不含其參考模式的微生物，目前對混合培養物、液體培養物中的微生物、絲狀真菌、未進行傳代培養樣本、病毒樣本均不適用，對某些指紋圖譜比較相似的細菌血清型如志賀菌和大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、氣單胞菌群、李斯特菌，肺炎鏈球菌等也很難區分。不同的地域環境、不同的實驗室間病原微生物培養方式，缺乏標準化的操作流程等[10-11]，時間飛行質譜技術還有許多問題亟待完善。

3.3本次研究的偏差與不足 盡管根據《WS/T82-1996蠟樣芽孢桿菌食物中毒診斷標準及處理原則》，此次事件從流行病史、現場衛生學調查、臨床癥狀及污染食品中蠟樣芽孢桿菌計數幾方面，判定事件結論為食用蠟樣芽孢桿菌污染的米粉導致的食源性疾病，但是否與患者嘔吐物中檢出的金黃色葡萄球菌存在關聯未進行進一步深入探索；并且，食源性致病菌的鑒定及事件溯源更多的是通過基因型別、分子型別或全基因組測序等方式獲得更為精準的結果[12]，如果本次事件能結合PFGE分型技術和毒力基因檢測技術綜合作為實驗室診斷的參考判定依據，對案例的分析及判定更有意義。