骨質疏松性骨折與非骨質疏松性骨折患者肌肉病理狀態及組蛋白甲基化的差異

王乾 孫攀 黃廷銳 黃晨 萬宏波 趙永見,3 鄔學群 王擁軍,3 施杞,3 唐德志,3*

1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032 2.上海中醫藥大學脊柱病研究所，上海 200032 3.教育部筋骨理論與治法重點實驗室，上海 200032

骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是老年人群高發骨折之一，尤其高發老年女性群體，其中髖部骨折的危害最大，所以又被骨科醫師形象地稱為“人生最后一次骨折”[1]。OPF的發生除了自身骨形成和骨吸收代謝紊亂外，跌倒是重要誘因[2]。有報道顯示，全球65歲以上老年人大約有35 %的比例會發生跌倒，而跌倒后發生骨折的概率更是接近15 %[3]。大量前瞻性研究更是證實肌少癥的發生與老年人跌倒和骨折的發生成正相關，肌少癥會引起骨骼肌功能的減退[4]。中醫學將肌肉與骨骼關系的失衡的現象稱之為“骨肉不相親”理論[5]，在論述治療骨折時強調筋骨并重，治療骨折的同時注重局部軟組織的保護。但是目前對于OPF患者肌肉病理狀態研究還不夠透徹，詳細了解OPF患者和非OPF患者肌肉病理狀態有助于我們深刻認知OPF這種疾病。

組蛋白甲基化修飾作為組蛋白密碼的重要組成部分，深刻影響著表觀遺傳學的調控，是目前表觀遺傳學研究的熱點之一[6]。SUV39H1是組蛋白甲基化酶，通過對染色質結構疏松緊密狀態的調控影響著目的基因的轉錄或沉默[7]。研究[8]發現SUV39H1可通過調控MYOD或輔助因子MEF2C調控抑制C2C12細胞的成肌分化。那么SUV39H1是否同樣會抑制OPF患者肌干細胞成骨分化呢？這需要對OPF患者肌肉的組蛋白甲基化情況進行研究，而目前OPF患者與非OPF患者肌肉的組蛋白甲基化情況尚不明確。故本實驗將OPF患者肌肉與非OPF患者肌肉進行病理染色和RT-qPCR檢測，旨在探究OPF患者與非OPF患者肌肉病理狀態及組蛋白甲基化情況差異，從而為為OPF的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 一般資料

于2021年11月至2022年1月在上海中醫大學附屬龍華醫院骨傷科住院部分別招募6例OPF患者和非OPF患者。其中OPF組患者男性2例，女性4例。年齡 67～80歲，平均(73.2±5.4)歲；體重為42～75 kg，平均體重為(58.49±8.76)kg；受傷部位：左側 3例，右側3例；骨折類型：股骨粗隆間骨折3例，肱骨干骨折2例，橈骨遠端骨折1例。非OPF組患者男性2例，女性4例。年齡 35～60歲，平均(42.6±6.0)歲；體重42～75 kg，平均(58.97±9.27)kg；受傷部位：左側3 例，右側 3例。骨折類型：股骨頸骨折1例，脛骨干骨折2例，腓骨骨折1例，蓋氏骨折2例。標本獲取前已征得患者同意，并簽訂知情同意書。本研究已通過上海中醫藥大學附屬龍華醫院倫理委員會審核批準(倫理批件號：2020LCSY087號)。

1.2 納入及排除標準

1.2.1納入標準：OPF患者納入標準：①60歲≤年齡<80歲的男性、女性患者；②有車禍、扭傷或跌傷等外傷史；③臨床癥狀及體征：患側肢體壓痛、縱向叩擊痛呈現陽性，患肢可捫及骨擦音或骨擦感或不明顯，患肢多數有畸形。④影像學表現：X線或CT顯示明顯骨折征象；雙能X線顯示骨質疏松(T≤-2.5)；⑤可耐受內固定手術患者。非OPF患者納入標準：①30歲≤年齡<60歲的男性、女性患者；②有車禍、扭傷或跌傷等外傷史；③臨床癥狀及體征：患側肢體壓痛、縱向叩擊痛呈現陽性，患肢可捫及骨擦音或骨擦感或不明顯，患肢多數有畸形。④影像學表現：X線或CT顯示明顯骨折征象；雙能X線顯示骨量正常(T值≥-1.0 )；⑤可耐受內固定手術患者。

1.2.2排除標準：不符合上述OPF患者和非OPF患者納入標準者；開放性骨折有軟組織缺損或感染者；體質較差難以進行手術者；不愿意參加此研究者。

1.3 實驗標本

實驗所需OPF患者肌肉標本和非OPF患者肌肉標本均來自上海中醫大學附屬龍華醫院骨傷科，患者骨折手術內固定時同時切取少量患側肌肉作為實驗標本。

1.4 主要試劑與儀器

H3K9me3、H3K9Ac抗體購自英國Abcam公司；HE試劑盒、檸檬酸鈉抗原修復液(50×)均購自上海碧云天有限公司；MASSON試劑盒購自北京索萊寶有限公司；Tissure RNA Purification kit plus 、Color Reverse Transcription kit、2×Color SYBR Green qpcr master mix均購自美國 EZBioscience公司；兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自中杉金橋；PCR引物由華大基因生物有限公司合成，具體引物序列見表1。Histobath 攤片機、Histoplate 烘片機、輪轉式切片機、全自動石蠟包埋機、自動脫水機均采購德國Leica公司；BX51、BX42正置熒光顯微鏡日本Olympus公司。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.5 標本獲取后處理

肌肉標本在無菌手術室獲取出以后，分成兩塊：一塊立即放入液氮罐中保存；另一塊放入10 %的中性福爾馬林中固定，固定24 h以后流水沖洗3 h，隨后放入脫水機常規脫水，后續進行石蠟包埋、切片。

1.6 實驗方法

1.6.1HE染色：標本 60 ℃烤箱 30 min，脫蠟至水；蘇木精染液 2 min，后蒸餾水沖洗 1 min，鹽酸乙醇分化 5 s；氨水返藍 15 s，后蒸餾水沖洗 1 min，伊紅染液 2 min；蒸餾水沖洗 1 min，乙醇分化，二甲苯透明后樹膠封片。

1.6.2MASSON染色：標本60 ℃烤箱 30 min，脫蠟至水；Weigert 鐵蘇木精染色10 min，酸性乙醇分化10 s，水洗；Masson 藍花液返藍4 min，水洗，蒸餾水洗1 min；麗春紅品紅染色液染色8 min，弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸洗2 min，弱酸工作液洗1 min；苯胺藍染色液浸染2 min，弱酸工作液洗1 min，95 %乙醇快速脫水；無水乙醇脫水3次，每次30 s；二甲苯透明3次，每次1 min，中性樹膠封片。

1.6.3實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR, RT-qPCR)：從液氮罐中取出肌肉標本，根據EZBioscience 總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，測定RNA濃度并監測提取RNA的質量是否符合進行下一步反轉錄的要求。將符合要求的RNA按照1 μg/20 μL 的體系采用EZBioscience反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，GAPDH為內參，按照EZBioscience實時熒光定量檢測試劑盒說明書進行擴增。采用2-△△ct法計算SUV39H1過表達穩轉株RUNX2、ALP、OPN、OCN、MYOD的mRNA相對表達量水平。表1為擴增所需引物，PCR反應條件為：第1步，95 ℃ 5 min；第2步，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共進行40個循環。

1.6.4免疫組化染色：標本 60 ℃烤箱 30 min，脫蠟至水；標本放入稀釋至1×的檸檬酸鈉抗原修復液中，微波爐適當時間抗原修復；加入適量內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBS水洗3 min 3次；滴加適量一抗(H3K9me3、H3K9Ac)，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3 min空3次；滴加適量反應增強液，室溫孵育20 min，PBS沖洗3 min 3次；滴加適量新鮮配置的DAB顯色液，室溫孵育5 min；自來水沖洗，蘇木精染色液孵育20 s，鹽酸乙醇分化，沖洗返藍；梯度乙醇分化，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 肌肉HE染色檢測結果

對兩組患者骨折部位肌肉的橫斷面和縱切面HE染色，可發現非OPF患者的肌肉更加緊實，OPF患者的肌肉較松弛。表明OPF患者易產生肌無力而跌倒。見圖1。

圖1 兩組患者肌肉橫切面(左)與縱切面(右)HE染色Fig.1 HE staining of transverse (left) and longitudinal (right) sections of muscle in both groups

2.2 肌肉MASSON染色檢測結果

對兩組患者骨折部位肌肉的橫斷面和縱切面MASSON染色，觀察膠原纖維在肌肉內部的分布，可發現OPF患者的肌肉膠原纖維分布多于非OPF患者，這可能是OPF患者肌力下降的原因。

2.3 肌肉RT-qPCR檢測結果

通過實施定量PCR，我們檢測了OPF患者和非OPF患者骨折部位肌肉SUV39H1基因，檢測結果發現OPF患者骨折部位肌肉SUV39H1表達水平較非OPF患者高，差異具有統計學意義。

圖2 兩組患者肌肉橫切面(左)與縱切面(右)MASSON染色Fig.2 MASSON staining of transverse (left) and longitudinal (right) sections of muscle in two groups of patients

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.4 骨折斷端肌肉H3K9Ac免疫組化染色檢測結果

對兩組患者骨折部位肌肉H3K9Ac免疫組化染色顯示，非OPF患者骨折部位肌肉H3K9Ac表達高于OPF患者，說明OPF患者肌肉組蛋白乙酰化水平較低。

圖4 兩組患者肌肉H3K9Ac免疫組化染色Fig.4 Immunohistochemical staining of muscle H3K9Ac in two groups of patients

2.5 骨折斷端肌肉H3K9me3免疫組化染色檢測結果

對兩組患者骨折部位肌肉H3K9me3免疫組化染色顯示，OPF患者骨折部位肌肉H3K9me3表達高于非OPF患者，說明OPF患者OPF患者肌肉組蛋白甲基化水平較高。

圖5 兩組患者肌肉H3K9me3免疫組化染色Fig.5 Immunohistochemical staining of muscle H3K9me3 in two groups of patients

3 討論

OPF是一種增齡性病理骨折，老年人是其易感人群。OPF的發生極其隱匿，呈漸進性進展，很容易被大家忽視，直至患者出現骨折結局，因此造成的危害極大。由于我國作為最大的老齡化國家，OPF人群基數龐大，該病的治療已引起社會廣泛關注[9]。目前針對OPF的治療主要是手術為主，外加抗骨質疏松藥物治療。臨床上抗骨質疏松的藥物根據其作用機制主要分為3類：促進骨形成藥物、抑制骨吸收藥物及介于二者之間的多靶點藥物。鈣劑、維生素D及雙膦酸鹽類藥物是目前治療OP的臨床一線藥物，早期合理的聯合應用可有效改善骨質疏松狀況，降低OPF發生的風險。但是長期服藥引起的不良反應如胃腸道不良反應、下頜骨壞死，增加乳腺癌、血栓等患病風險，一定程度上限制了其臨床應用[10-11]。縱觀OPF的診療，人們往往把治療的重心放在骨上，而對肌肉的關注程度還遠遠不夠。

大數據分析顯示，OPF的發生常合并眾多疾病，而肌少癥是值得我們關注的焦點[12]。肌肉和骨骼解剖上毗鄰，功能上互為影響。肌少癥引起的肌肉質量下降是跌倒發生的易感因素，而跌倒又是OPF發生的直接誘因。對于肌肉和骨病理層面的探究，中醫典籍中早有論述。《素問·痿論》指出：“脾氣熱，則胃干而渴，肌肉不仁，發為肉痿；腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿”，揭示了痿證的治療時應注重調控脾腎及脾胃，豐富了痿證的治療理論[13]。中醫學治療骨折更是強調筋骨同治，在注重骨折治療的同時加強肌肉、肌腱、筋脈的保護[14]。本研究通過對OPF和非OPF患者骨折部位肌肉進行HE染色、MASSON染色發現OPF患者肌肉較非OPF患者肌肉質地更加松弛，膠原纖維含量明顯增多。這一發現進一步闡明了OPF患者肌力下降的原因，加深了對OPF疾病的認識，同時也告誡我們在平時OPF的診療過程中要加強對肌少癥的調護，管理的時間點也不應局限在治療時，而應重視平時的干預。“骨肉不相親”是OPF發生的重要誘因，因此在OPF的防治中，加強對肌肉的調護是未來OPF治療的一個發展方向。

組蛋白甲基化作為表觀遺傳修飾的一種，一般是指發生在H3或H4組蛋白氨基端殘基上的甲基化，由組蛋白甲基轉移酶(histone methyltransferases, HMTs)催化，作用是改變目的基因的轉錄調控[15]。組蛋白甲基化對基因轉錄程度的調控主要受發生甲基化的位點以及結合甲基數目決定[16]。SUV39H1屬于賴氨酸甲基轉移酶家族的一員 ，主要通過催化第九位的賴氨酸殘基位點，發揮表觀遺傳修飾功能。對于組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(HKMT)，通常認為H3K9的乙酰化可以促進目的基因的轉錄，H3K9的甲基化對基因的轉錄的起抑制作用，并且H3K9的三甲基化是難以去除的[17]。目前針對SUV39H1的研究大多集中在腫瘤領域，相關研究顯示SUV39H1參與眾多腫瘤的發生發展及轉歸[18-19]。對于OPF患者肌肉組蛋白甲基化狀態的研究相對匱乏。本研究我們通過RT-qPCR發現OPF患者肌肉SUV39H1基因相對表達量較非OPF患者高(P<0.001)。我們進一步對OPF患者和非OPF患者肌肉進行免疫組化染色發現OPF患者較非OPF患者肌肉H3K9me3甲基化程度高、H3K9Ac乙酰化程度低。這一發現進一步豐富OPF患者表觀遺傳學理論，為我們后期治療提高了新思路。

綜上所述，本研究表明與非OPF患者肌肉相比，OPF患者肌肉更加松弛，膠原纖維含量增高，而這可能是由于肌肉組蛋白甲基化程度升高，乙酰化降低造成的。本研究以OPF患者肌肉與組蛋白甲基化的聯系為切入點，這為OPF的治療提供了相關實驗數據和理論支持，也提供了新的思路與方法。但是由于本實驗存在樣本量少，組蛋白甲基化與肌肉病理直接機制尚未闡明，還需要后續實驗進一步驗證和完善。