高糖對骨髓間充質干細胞作用機制的研究進展

常俊杰 解強 劉亦冰 戴文昊 高俊,2* 張曦,2

1.南京中醫藥大學常州附屬醫院，江蘇 常州 213003 2.張曦名中醫工作室，江蘇 常州 213003

糖尿病性骨質疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是一種繼發于糖尿病的全身性的代謝性骨病。在高糖(high glucose，HG)環境下，無論是1型糖尿病還是2型糖尿病，骨形成與骨吸收的動態平衡均被打破，引起骨代謝紊亂。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多譜系分化及自我更新的潛能，因此成為研究骨質疏松癥發病機制的重要靶點，也憑其來源廣泛、免疫原性低等優勢成為骨組織工程理想的種子細胞。本文綜述HG對BMSCs的作用機制，有利于突破DOP干細胞療法的局限性，挖掘潛能優勢。

1 BMSCs與DOP的關系概述

在骨髓微環境中，BMSCs的增殖、凋亡、分化、遷移等參與了骨代謝這一復雜的生物學過程。在長期HG環境下，干細胞會發生代謝紊亂，具體表現為，提前老化甚至凋亡、增殖受損、遷移緩慢、分化及旁分泌功能障礙等[1]。BMSCs的功能改變與功能障礙是DOP病態骨代謝模式的根本原因[2]，因此，BMSCs的功能活性與DOP的發生發展密切相關。

目前，不論是糖尿病還是骨質疏松癥，其治療不僅僅局限于藥物療法，而更多擴展到細胞療法。越來越多的研究[3]表明，BMSCs在二者治療方面都發揮了巨大的潛力。有研究[4]發現，將BMSCs植入顱骨缺損大鼠模型中，不僅可以觀察到新骨形成，同時堿性磷酸酶等成骨標志物的表達也有所升高。然而，許多研究證實，移植到糖尿病患者體內的BMSCs由于長期受到HG環境的“污染”，導致其出現衰老凋亡、增殖能力降低、成骨分化受損等一系列的不良表現，降低了其功能效應，甚至引發骨質疏松癥，這無疑限制了BMSCs對DOP的治療效益與應用價值。因此，深入研究HG對BMSCs的作用機制有利于為臨床治療DOP提供新思路。

2 HG對BMSCs的作用機制

2.1 HG影響BMSCs增殖

綜合多個HG對BMSCs增殖影響的研究，我們發現，由于實驗采用的細胞種屬、細胞系、培養方式等的不同，結果不一。蔣孟佚[5]研究顯示，長期HG會削減大鼠BMSCs的增殖。但Li等[6]證實，HG對人BMSCs與大鼠BMSCs增殖影響的結果相反，即HG會促進人BMSCs的增殖，其原因大概是，與鼠BMSCs相較，人BMSCs的干細胞特性更強，可以抵抗HG毒性。此外，趙同平等[7]研究認為，HG在短期內可以增強小鼠BMSCs增殖水平,但長期來看，HG又會抑制這種增殖效應。對于不同葡萄糖水平的定義，韋恩秀等[8]提出，處于細胞增殖峰值的葡萄糖水平為正糖，低或高于此水平則分別稱之為低糖或HG，且在實驗研究中，將小鼠BMSCs增殖活性最佳的22.5和50.0 mmol/L葡萄糖水平定為正糖，并發現，經22.5 mmol/L正糖預處理后，更換不同葡萄糖濃度再持續培養時，與正糖狀態相比，100～300 mmol/L的短暫HG具有促增殖作用，即短暫HG可以提高小鼠BMSCs增殖水平，而且這種短暫HG促增殖作用只對正糖預處理成立，對低糖預處理或交替培養不成立，然而，無論是HG持續性培養還是HG間歇性培養，一旦時間延長，都會抑制BMSCs增殖。

2.2 HG促進BMSCs凋亡

細胞凋亡是在一系列凋亡信號誘導下引發細胞內級聯反應從而導致細胞發生主動死亡。研究[9]表明，HG(55 mmol/L)可提高小鼠BMSCs凋亡率，長期HG會引起晚期糖基化終末產物積累，導致BMSCs凋亡。由于HG可以誘發氧化應激，程韶等[10]研究認為，大量活性氧能介導Wnt/β-catenin、Pl3K/AKT等信號通路，使BMSCs凋亡與衰老，進而使骨重建失衡。另有研究[11]表明，以HG高脂或炎性因子等來模擬糖尿病微環境能夠引起BMSCs凋亡。

2.3 HG促進BMSCs自噬

自噬是真核細胞在應激狀態下為維持內環境穩定，產生自噬溶酶體，降解自身內部受損細胞器、大分子蛋白質等，進而調節關鍵因子等的表達，以介導機體新陳代謝的一類機體損傷保護機制。Beclin1和LC3Ⅱ是自噬相關因子，其表達變化可以反映細胞自噬程度[12]。現代研究指出自噬與骨代謝疾病緊密相關，自噬介導的骨代謝失衡是多種骨病的根源。研究[13]發現，自噬可以通過Hedgehog、Wnt/β-catenin、AMPK/mTOR、BMPs/Smad、RANK/RANKL等信號通路調節2型糖尿病骨代謝。劉艷等[12]研究認為，HG會促進BMSCs中Beclin1和LC3Ⅱ的表達，使細胞產生更多的自噬體，表明HG環境可以增強BMSCs的自噬程度，揭示了BMSCs的自噬失衡可能與DOP相關。張平[14]也指出，在HG高胰島素狀態下，BMSCs會加速衰老，其自噬程度會得到加強。同時，HG狀態下，BMSCs表現出早衰傾向，IL-6等衰老相關炎性細胞因子分泌增加，BMSCs可能是通過自噬介導的衰老來避免凋亡以保持細胞存活。此外，DOP的發生與細胞氧化應激水平密切相關，而線粒體是細胞氧化應激發生的主要場所。因此，線粒體功能受損對于BMSCs的成骨分化有一定的抑制作用[15]。線粒體自噬被認為是一種降解受損或老化的線粒體的特殊細胞存活機制[16]。近年來一些研究[17]發現，線粒體自噬和BMSCs的成骨分化密切相關，而且HG可能會抑制大鼠BMSCs在成骨分化過程中的線粒體自噬現象。

2.4 HG誘導BMSCs鐵死亡

鐵死亡是近年來發現的區別于細胞凋亡、自噬、壞死等的一種氧化性死亡方式，其特征表現為鐵依賴性的細胞內脂質活性氧生成與降解失調[18]。有研究[19]指出，DOP與慢性鐵蓄積導致的活性氧升高密切相關。張希等[20]研究認為，HG會引起BMSCs內的活性氧和脂質過氧化產物增加，且使BMSCs線粒體萎縮、膜密度增加、內膜嵴減少，從而使BMSCs發生鐵死亡，抑制其成骨分化。現代研究關于其具體作用機制尚未完全闡明，但部分研究[21]指出，鐵過載可以抑制BMSCs的Wnt信號，誘導鐵死亡，從而抑制BMSCs成骨分化，過量的鐵通過下調BMSCs中Runx2的表達來抑制其成骨分化[22]，鐵過載誘導BMSCs產生活性氧，從而干擾了BMSCs成骨分化過程[23]。然而，在HG環境下，有關BMSCs鐵代謝與骨代謝的相關性仍需進一步研究。

2.5 HG誘導BMSCs分化

來源于胚胎時期中胚層的BMSCs具有多向分化的潛能，可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、血管內皮細胞等多種類型。

2.5.1成脂-成骨分化：BMSCs成骨分化在骨形成、維持及骨重建中都具有著重要的作用。目前影響BMSCs成骨分化的信號通路包括RANKL/RANK/OPG、Wnt、MAPK、AGEs/RAGE、Smad、Notch等，炎癥、氧化應激等狀態也影響BMSCs的分化能力。目前普遍認為PPARγ(過氧化物酶體增值激活受體)、Runx2是影響BMSCs成骨和成脂分化的關鍵轉錄因子，Wnt/β-catenin是影響BMSCs成骨和成脂分化的關鍵信號通路[24]。然而迄今為止，由于細胞來源不同或細胞代謝需求等的原因，HG對BMSCs的成骨分化存在一些爭議。Yamawaki等[25]認為在HG環境下BMSCs可以產生更多的骨鈣素和鈣沉積，另有一些研究發現，BMSCs的功能依賴于葡萄糖的攝取。然而，更多的研究[26-28]發現，HG可以通過調節miR-493-5p/ZEB2或GSK3β、Hedgehog、NF-κB信號通路抑制BMSCs成骨分化。此外，HG還會促進BMSCs成脂分化，導致脂肪在骨髓腔中積累，進而使骨質、骨強度下降[29]。HG通過促進BMSCs的脂滴形成及PPARγ等成脂分化標志基因的上調表達，而減緩鈣結節形成，抑制Runx2等成骨分化標志基因的表達來干擾其向成骨分化[30]。

2.5.2成血管-成骨分化：骨組織是一種高度血管化的組織，在靜息狀態下，骨血流量可占心輸出量的10 %～15 %[31]。骨內血管不僅可以提供營養支持、運送代謝產物，而且與骨形成密切相關，是保持骨組織結構完整性的關鍵因素。集中在生長板干骺端、骨內膜、骨膜下區域的H型血管可以介導血管生成和骨形成的偶聯過程[32]。H型血管的豐富度是評價機體衰老和骨量多少的敏感指標[33]。研究[34]表明，年齡相關的H型血管減少與骨質疏松癥的發生發展密切相關，受損的骨量可以通過促進H型血管的生成來得到改善。H型血管可以參與調控BMSCs的分化過程[35]，BMSCs可以通過促血管生成從而促進成骨。HG會抑制BMSCs向血管內皮細胞分化[36]，而且HG削弱BMSCs向血管內皮細胞分化的機制可能就是HG自身或受其干預的生長因子促進了BMSCs的凋亡，使BMSCs的增殖受損，從而使BMSCs成血管分化能力減弱。

2.6 HG影響BMSCs的定向遷移

BMSCs進入外周血循環時，在各種因子的相互作用下，可以附著在血管內皮細胞上，同時G蛋白偶聯受體與其結合，經激活的BMSCs能夠在骨受損區參與骨形成過程，在骨損傷的再生修復過程中，BMSCs的募集發揮了重要作用[37]。BMSCs向骨受損區的募集與其定向遷移能力密切相關，而且應用BMSCs治療骨質疏松癥時，需要其定向遷移至骨組織才能使治療效益最大化。

趨化因子及其受體是調控BMSCs定向遷移的重要因素。基質細胞衍生因子-1(SDF-1)是一種趨化因子，與其G蛋白偶聯受體CXCR-4相互作用可發揮細胞趨化功能。許多研究表明，SDF-1在骨受損區高度表達，BMSCs可以在SDF-1/CXCR-4通路的趨化作用下，定向遷移至骨受損區，從而發揮骨形成功能。然而，張博[38]發現，在HG環境下，CXCR-4的表達受抑制，從而影響SDF-1/CXCR-4通路對BMSCs定向遷移能力的調控。此外，HG會使BMSCs過早老化，分泌大量炎性因子，抑制BMSCs的定向遷移。唐雪[39]表明，模擬糖尿病的HG無血清狀態，可使BMSCs的旁分泌因子減少，進而影響其遷移能力。這些研究都表明HG可以抑制BMSCs的定向遷移，限制BMSCs向骨受損區募集，進而影響骨代謝的過程。然而有學者[40]表示，HG可促進人BMSCs的遷移。

2.7 HG影響BMSCs的旁分泌功能

研究發現在外界微環境刺激下，BMSCs可以通過旁分泌多種生長因子促進骨修復和再生。這些生長因子包括胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TG-β1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等可以影響成骨細胞活性，從而使BMSCs參與骨重建與血管形成的耦合過程以修復骨缺損[41-42]。王廣闊等[43]研究認為，BMSCs可以通過旁分泌作用使成骨相關基因Osterix、Runx2、OPN表達上調，從而提高成骨細胞成骨活性，也會使成骨細胞遷移相關基因MMP-2、MMP-9表達上調，從而促進成骨細胞趨化遷移到骨損傷部位，此外，BMSCs旁分泌作用還能增強成骨細胞增殖能力、成骨礦化能力。然而，在HG環境下，BMSCs的旁分泌作用被抑制[44-45]。

3 結語與展望

BMSCs的生物活性與功能特性與DOP的發生、發展及治療均有著密不可分的聯系。研究HG對BMSCs的影響作用，既可以深入了解DOP的發病機制，又可以為干細胞療法發揮更優效益提供理論支持。綜上所述，HG對BMSCs的作用存在雙向性，一方面，在HG環境下，BMSCs會加速凋亡、鐵死亡及成脂向分化，而減緩旁分泌及成血管向分化，進而抑制成骨；另一方面，HG通過促進BMSCs及線粒體自噬，保存細胞活性，一定程度上會促進成骨。在BMSCs增殖方面，HG對不同來源的細胞系有不同作用傾向，但一般認為，短暫HG會促進BMSCs增殖，持續HG會抑制BMSCs增殖。此外，HG對BMSCs定向遷移也有不同的作用傾向，但大部分研究表明，HG會抑制其定向遷移能力。

雖然越來越多的學者通過研究HG對BMSCs的影響來間接為DOP的治療提供實驗論據，但其具體機制還有待進一步明確。而且，基礎與臨床研究均證明，DOP患者的BMSCs并非單純處于HG環境下，其鐵、脂、激素、蛋白質水平均處于異常狀態，因此，HG對BMSCs的影響與其它物質代謝之間又具有一定的聯系，并且是交互影響的，存在著錯綜復雜的關系網絡，故對DOP的理論認識仍需要日益更新。