環狀RNA在骨質疏松癥中的研究進展

曹年平 陳波波 黃崇峻 徐瑩 田野*

1. 中國醫科大學附屬盛京醫院骨科，遼寧 沈陽 110004 2. 中國醫科大學附屬盛京醫院麻醉科，遼寧 沈陽 110004

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)好發于老年人、絕經后女性和糖皮質激素用藥者，因其致骨折風險增高，嚴重影響人們的生活質量。然而目前仍沒有特效治療能逆轉OP骨質丟失，亟需研究OP發生機制并開發更有效的治療方法。最新研究發現環狀RNA有望成為OP的診斷標志物和治療新途徑。環狀RNA(circRNAs)是由反向剪接形成的無5’末端帽子和3’末端poly(A)尾的共價閉合環狀結構的非編碼RNA[1]。已知circRNAs可作為miRNAs和蛋白質的海綿，抑制miRNAs和蛋白質功能；circRNAs還可以調控轉錄以及部分翻譯為蛋白質或作為蛋白質支架發揮作用[2]。近年來大量研究表明circRNAs在心血管系統疾病、神經系統疾病和骨科疾病[3-7]等中起重要作用。本文將對circRNAs在多種類型OP中發揮的調控作用和診斷價值進行綜述。

1 CircRNAs調控絕經后骨質疏松癥

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由于絕經后女性雌激素水平下降，成骨-破骨活動偏向于骨吸收而形成的骨代謝性疾病。CircRNAs在PMOP中存在差異表達。外周血單核細胞RNA測序結果顯示，PMOP患者有73個circRNAs顯著上調和300個circRNAs顯著下調[8]。一些circRNAs可調節BMP-2表達。BMP-2屬于轉化生長因子β超家族蛋白，可誘導干細胞成骨分化。PMOP患者中circ_0016624和circ_0048211均顯著降低，兩者過表達時均使BMP-2表達升高。經靶點預測和雙熒光素酶報告基因實驗得出circ_0016624海綿抑制miR-98以及circ_0048211海綿抑制miRNA-93-5p，從而提高了BMP-2表達，并促進干細胞向成骨細胞轉化[9-10]。由此可見，促BMP-2表達的circRNAs生成減少是PMOP發生機制之一。此外，circ_0001795[11]在PMOP患者骨組織中表達降低。骨髓基質細胞過表達circ_0001795后破骨分化受抑制，其機制是circ_0001795抑制miR-378作用而提高BMP-2表達，這可能對抑制PMOP進展具有重要作用。

外泌體是細胞分泌的含有信息交流物質的小囊泡。PMOP患者骨髓間充質干細胞(BMSCs)分離的外泌體行微陣列測序，發現237個上調和279個下調的 circRNAs[12]。Zhi等[13]發現PMOP患者血清分離的外泌體中circ_0006859顯著升高，體外實驗證實circ_0006859通過海綿miR-431-5p上調ROCK1表達來抑制骨生成并促進脂肪生成。因此，circRNAs可能以外泌體形式作用于成骨細胞和破骨細胞，對骨微環境發揮調節作用。

2 CircRNAs調控老年性骨質疏松癥

老年性骨質疏松癥(senile osteoporosis，SOP)是與衰老有關的原發性骨質疏松癥，骨髓間充質干細胞老化和成骨能力下降是其重要的發病機制[14]。最新研究[15-16]表示SOP與circRNAs的表達調控有關。對老年男性骨質疏松性椎體壓縮骨折患者的外周血RNA測序，發現884個差異表達的 circRNAs(554個上調，330個下調)[15]。KEGG分析顯示差異表達的circRNAs功能主要與“RNA轉運、MAPK信號通路、TP53轉錄調控”等通路有關。另一項研究[16]對老年男性骨質疏松患者的BMSCs行RNA測序，篩選出circ_0006215顯著降低。過表達circ_0006215能促進BMSCs成骨分化，其機制是circ_0006215作為miR-942-5p海綿而促進成骨因子RUNX2和血管內皮生長因子VEGF表達。并且過表達circ_0006215的BMSCs培養上清液可促進人臍靜脈內皮細胞遷移和血管生成。因此，circ_0006215具有促進骨生成和血管生成的潛力，其表達降低可能是SOP形成的重要原因。

3 CircRNAs調控激素性骨質疏松癥

糖皮質激素(glucocorticoid，GC)作為抗炎和免疫抑制劑被廣泛應用，但長期GC治療可導致糖皮質激素性骨質疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIO)。研究[17]表明GC可抑制成骨細胞生成，促進骨細胞凋亡，同時延長破骨細胞的壽命。有報道[18]miRNAs參與GIO形成，如Let-7f-5p可調節TGFBR1表達，改善GIO骨量丟失，而circRNAs具有miRNAs海綿等功能也能調控GIO的發生發展。

Wang等[19]發現circRNAs在GIO中具有促進骨生成的作用。Wang等在細胞和動物模型中過表達circ_0006393能上調成骨基因的表達和提高GIO模型小鼠的骨密度。深入研究發現，circ_0006393海綿結合miR-145-5p而上調FOXO1表達。FOXO1是抑制成骨細胞氧化損傷的關鍵蛋白，具有促進成骨的作用[20]。地塞米松抑制成骨細胞生長并促進其凋亡，如何解決這個問題是治療GIO的關鍵。研究[21]發現，敲除circ_0001275后可改善地塞米松對成骨細胞生長的不利影響，其可能機制是敲除circ_0001275后，miR-377/CDKN1B 軸被激活從而逆轉GC對成骨細胞生長的抑制。

許多研究[18,22]表示miRNAs在GIO中具有調控作用。CircRNAs作為miRNAs調節分子，能否通過廣泛影響miRNAs作用而調控GIO發生發展，有待進一步研究。總之，以上三種類型OP中均有circRNAs表達改變并通過miRNAs海綿發揮調控作用，見表1。

表1 3種類型骨質疏松癥中circRNAs的調控作用及機制Table 1 The regulatory role of circRNAs in three types of osteoporosis

4 CircRNAs對骨內細胞的調控作用

4.1 CircRNAs對干細胞的調控

多種干細胞具有成骨分化潛能，包括骨髓間充質干細胞(BMSCs)、脂肪干細胞(ASCs)和牙髓干細胞(DPSCs)等。研究表明circRNAs能促進干細胞成骨分化。Yang等[23]發現circ-VANGL1能海綿抑制miR-217而提高RUNX2表達。RUNX2是成骨分化轉錄因子，已證實在ASCs等干細胞成骨分化中起重要作用[24]。基于RUNX2改善骨質疏松癥作用，研究其上游機制發現circRUNX2和circ_0011269也能促進RUNX2表達[25-26]，并通過circRUNX2/miR-203/RUNX2和circ_0011269/miR-122/RUNX2通路促進BMSCs成骨分化。

現有研究大多關于circRNAs在BMSCs中的作用，但circRNAs也調控其他干細胞。Ji等[27]在牙髓干細胞(DPSCs)中發現circ_0026827能海綿結合miR-188-3p，上調自噬促進因子Beclin1和成骨促進因子RUNX1表達，促進DPSCs成骨分化。Shen等[28]發現circFOXP1在OP患者中顯著下調，并且circFOXP1可以作用于miR-33a-5p而上調FOXP1表達，促進ASCs成骨分化，同時在老鼠模型中過表達circFOXP1能促進ASCs異位成骨，表明circFOXP1具有促進骨生成和預防骨質疏松的潛在作用。

CircRNAs對干細胞成骨分化有積極作用，然而circRNAs也可能促進骨質疏松。Lin等[29]發現去卵巢小鼠模型中circ-SLC8A1高表達并通過海綿結合miR-516b-5p，使A激酶錨定蛋白2上調，從而促進骨質疏松癥進展。研究[30]表示低強度激光照射可提高BMSCs增殖能力，因其下調circ_0001052，升高miR-124-3p水平，激活促增殖的Wnt/β-catenin通路。還有褪黑素能降低circ_0003865表達而促進BMSCs成骨分化[31]。因此，一些circRNAs可能對BMSC增殖和成骨分化存在負性作用。

4.2 CircRNAs對成骨細胞的調控

CircRNAs能調節前成骨細胞增殖和凋亡。研究[32]發現過表達circRNA AFF4促進前成骨細胞MC3T3-E1增殖和抑制其凋亡。其中circRNA AFF4通過海綿結合miR-7223-5P使PIK3R1升高而促進MC3T3-E1增殖。還有研究[33]從鼠BMSCs中分離出含有circ-Rtn4的外泌體(Rtn4-Exos)與MC3T3-E1共培養后可減輕TNF-α對MC3T3-E1的細胞毒和細胞凋亡，提示Rtn4-Exos是成骨細胞的保護因子。除了影響前成骨細胞增殖和凋亡，circRNAs還能調節前成骨細胞的成骨分化和骨礦化。Circ_003795[34]在MC3T3-E1和MDPC-23細胞(小鼠成牙本質細胞)成骨分化中顯著升高。研究得出circ_003795可以作用于miR-1249-5p，并上調COL15A1表達，促進MC3T3-E1和MDPC-23細胞成骨分化及礦化。

4.3 CircRNAs對破骨細胞的調控

骨髓單核/巨噬細胞(bone marrow monocyte/macrophage cells，BMMCs)是破骨細胞的前體，破骨細胞大量生成使骨吸收增加，引起骨質疏松。研究表明circRNAs能促進破骨細胞生成。Chen等[35]在誘導BMMCs破骨分化時發現circRNA_28313顯著上調，并且circRNA_28313可以解除miR-195a對促破骨分化進基因CSF1的抑制，從而促進破骨細胞分化。Miao等[36]發現成熟破骨細胞中circRNA_009934升高明顯，過表達circRNA_009934促進BMMCs增殖和破骨分化，而抑制circRNA_009934時，破骨細胞生成減少，因為circRNA_009934可海綿結合miR-5107，上調促破骨分化基因TRAF6表達，從而促進BMMCs增殖和破骨細胞生成。

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)能促進破骨分化并抑制成骨分化[37]。研究發現TNF-α誘導破骨細胞分化時，circHmbox1表達降低，并通過影響下游miR-1247-5p和Bcl6 表達促進破骨細胞生成。TNF-α促進破骨細胞分泌含circHmbox1的外泌體，此外泌體與前成骨細胞共培養時，可抑制成骨分化。因此，circHmbox1是TNF-α誘導破骨分化和抑制成骨分化的重要調節因子[38]。以上circRNAs在骨內細胞中的調控作用和海綿機制靶點見表2。

表2 骨內細胞中circRNAs的調控作用及機制Table 2 The regulatory role of circRNAs in bone cells

5 CircRNAs在骨質疏松癥中的通路研究

成骨分化和礦化是骨生成的關鍵途徑，許多信號通路參與其中，包括Notch[39]、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[40]、Wnt/β-catenin[41]等信號通路。研究表明許多circRNAs能調節信號通路基因促進成骨分化。Huang等[41]發現BMSCs和MC3T3-E1成骨分化過程中YAP1升高。有報道[42]YAP1能激活Wnt/β-catenin通路促進成骨。探究YAP1上游機制發現，circ_0024097可解除miR-376b-3p對YAP1的抑制，促進YAP1表達[41]。因此circ_0024097通過Wnt/β-catenin通路促進BMSCs和MC3T3-E1的成骨分化。此外，研究[40]發現circRNA CDR1as通過miR-7/GDF5軸，激活Smad1/5/8和p38 MAPK通路，促進牙周膜干細胞的成骨分化。可見circRNAs可能調控多種信號通路，影響OP的發展。

6 CircRNAs作為骨質疏松癥診斷和預后生物標志物

骨質疏松癥(OP)診斷的金標準是測量骨密度計算T值。若T值低于-2.5，即診斷為OP[43]。臨床上外周靜脈血便于獲取，而circRNAs有較穩定的環狀結構，可能成為新的OP診斷和預后標志物。Xiang等[44]分別檢測健康人、骨量減少人、OP患者血漿，發現OP患者血漿中circ_0001445顯著降低。皮爾遜相關分析示circ_0001445與T值呈正相關，與反映骨吸收的β-CTx呈負相關；ROC曲線示circ_0001445對診斷OP的靈敏度和特異性分別為97.62 %和82.22 %。OP患者治療6個月后，circ_0001445水平上調。因此，綜合分析circ_0001445可作為OP診斷和判斷預后標志物。

研究發現一些circRNAs上調可能提示OP的發生。PMOP患者外周血單核細胞中檢測到circ_0001275顯著升高[45]。ROC曲線示circ_0001275對PMOP患者有診斷價值。從58例PMOP患者和60例健康人血清分離的外泌體中發現，PMOP組circ_0006859顯著升高。經分析circ_0006859以ROC曲線下面積0.897 4，93.1 %的高靈敏度和93.33 %的高特異性可用于診斷PMOP[13]。雖然circRNAs在臨床疾病診斷中未廣泛應用，但circRNAs較線性RNA穩定，隨著circRNAs相關研究不斷深入，其臨床應用前景將會逐漸體現。

7 總結與展望

CircRNAs可調控干細胞成骨分化和單核巨噬細胞破骨分化影響骨質疏松癥進展，還能調節多種成骨信號通路并作為骨質疏松癥生物標志物。然而，近年來circRNAs雖在許多疾病中廣泛研究，但在骨質疏松癥中研究還處于起步階段，且主要集中于研究circRNAs的miRNAs海綿機制。CircRNAs能否調控更多成骨信號通路以及circRNAs作為蛋白質支架和調控轉錄等其他機制是否存在骨質疏松癥中有待進一步研究。骨質疏松癥是亟需解決的健康問題，circRNAs的深入研究有望對其病因、診斷、治療和預后提供新的見解和解決方案。