lncRNA XIST靶向miR-302a-3p對IL-1β誘導軟骨細胞損傷的調控機制

黃濤 方紅育 周少懷 卞峰 任敏 李宏亮 俞詩威 嚴錦曦 錢慧 李嘉瓊

武漢市第三醫院骨一科，湖北 武漢 430060

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種以炎癥反應、關節軟骨細胞減少和軟骨基質丟失為特征的關節退行性疾病[1]。軟骨細胞的凋亡增加和過度炎癥反應有助于軟骨降解[2]。白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是關節炎癥后出現的主要細胞因子，參與OA軟骨細胞功能障礙，被廣泛用于體外OA模型的建立[3-4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)X染色體失活特異轉錄因子(X inactive specific transcript，XIST)被報道為肺癌、膠質瘤等多種腫瘤的癌基因[5-6]。有證據證實XIST通過吸附miR-302a-3p促進原發性韌帶成纖維細胞成骨分化[7]。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)被生物信息學預測為miR-302a-3p的靶基因，有報道[8]稱PDK1在OA患者軟骨組織中上調。但在OA中XIST和miR-302a-3p的相互作用及其與PDK1的作用并不明確。因此本研究采用IL-1β刺激軟骨細胞炎癥反應模擬體外OA環境，探討XIST、miR-302a-3p在OA細胞模型中的功能和調控機制，為OA的發病機制提供新的見解。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM購自北京諾博萊德公司；XIST的小干擾RNA(si-XIST)和過表達載體(pc-XIST)、miR-302a-3p模擬物(miR-302a-3p mimics)和抑制劑(miR-302a-3p inhibitor)及相應的陰性對照(si-NC、pcDNA、miR-NC mimics和miR-NC inhibitor)購自上海吉瑪制藥公司；IL-1β購自北京同立海源生物公司；Lipofectamine 3000購自美國英杰公司；Trizol試劑購自上海生工生物公司；TB Green Premix Ex Taq II Kit購自大連寶生物公司；MTT試劑盒購自北京索萊寶公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒購自上海銳賽生物公司；Bcl-2、Bax、PDK1、GAPDH一抗及其二抗購自美國Abcam公司。酶標儀購自美國賽默飛公司；流式細胞儀購自上海伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和IL-1β誘導：從青旗(上海)生物公司購買人軟骨肉瘤細胞系SW1353后，使用DMEM培養基培養。然后用濃度為10 ng/mL的重組人IL-1β處理SW1353細胞24 h，刺激細胞炎癥反應，從而在體外模擬OA樣軟骨細胞損傷[9]。

1.2.2細胞轉染：使用Lipofectamine 3000將1.1中的質粒分別轉染至SW1353細胞后再用IL-1β誘導細胞，將其記為IL-1β+si-NC組、IL-1β+si-XIST組、IL-1β+si-PDK1組、IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組、IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組，僅用10 ng/mL IL-1β誘導的細胞記為IL-1β組，未經任何處理的細胞記為Control組。

1.2.3qRT-PCR實驗：使用Trizol試劑從各組SW1353細胞中提取總RNA。將2 μg定量RNA反轉錄為cDNA，然后按照生產說明書用TB Green Premix Ex Taq II Kit進行PCR擴增。相對表達分析通過2-ΔΔCt法進行。使用GAPDH對TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、XIST或PDK1的表達進行標準化，使用U6對miR-302a-3p進行標準化。

1.2.4MTT實驗測定細胞活力：SW1353細胞(2×103個/孔)接種于96孔板過夜。然后加入20 μL MTT孵育4 h，然后加入200 μL/孔的DMSO孵育10 min。用酶標儀檢測490 nm波長下的吸光度。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡：轉染后的SW1353細胞用PBS洗滌并暴露于胰蛋白酶溶液中。2 000 r/min離心8 min后在300 μL結合緩沖液中重懸。將細胞懸液與5 μL Annexin V-FITC在25 ℃避光混合15 min后，用2.5 μL PI孵育約5 min，流式細胞儀觀察凋亡細胞。

1.2.6雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-302a-3p與XIST或PDK1的靶向關系：ENCORI和Targetscan數據庫分別預測miR-302a-3p與XIST或PDK1的假設結合位點。通過分子克隆將XIST和PDK1 3’ UTR的cDNA序列及其突變序列分別插入pmirGLO報告載體，生成野生型(WT-XIST和WT-PDK1)和突變型(MUT-XIST和MUT-PDK1)熒光素酶報告質粒。24孔板中IL-1β處理過的SW1353細胞與這些重組質粒和miR-302a-3p mimics或miR-NC mimics共轉染。48 h后，使用雙熒光素酶報告分析系統評估熒光素酶活性。

1.2.7免疫印跡法檢測Bcl-2、Bax及PDK1表達：用SDS-PAGE分離從各組SW1353細胞中提取的蛋白質，轉移到PVDF膜上，然后在脫脂牛奶中進行非特異性信號阻斷和一抗(anti-Bcl-2、anti-Bax、anti-PDK1和anti-GAPDH)培養。然后將二抗在室溫下孵育至膜上1 h，最后用增強的化學發光試劑進行免疫印跡，用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 XIST和miR-302a-3p在IL-1β誘導的SW1353細胞中的表達

與Control組[(1.00±0.03)、(1.00±0.03)]比較，IL-1β組SW1353細胞中XIST表達(3.39±0.21)升高，miR-302a-3p表達(0.41±0.01)降低(P<0.05)。

2.2 敲低XIST對IL-1β誘導的SW1353細胞增殖、凋亡的影響

與Control組相比，IL-1β組XIST表達上調，細胞活力、Bcl-2表達下降，凋亡率、Bax表達增加(P<0.05)；與IL-1β組和IL-1β+si-NC組相比，IL-1β+si-XIST組XIST表達下調，細胞活力、Bcl-2表達升高，凋亡率、Bax表達下降(P<0.05)，見圖1、圖2和表3。

表3 敲低XIST對IL-1β誘導的SW1353細胞增殖、凋亡的影響Table 3 Effects of knockdown of XIST on the proliferation and apoptosis of SW1353 cells induced by IL-1β n=6)

圖1 敲低XIST對IL-1β誘導的SW1353細胞凋亡的影響Fig.1 Effects of knockdown of XIST on IL-1β-induced apoptosis in SW1353 cells

注：A：Control組；B：IL-1β組；C：IL-1β+si-NC組，D：IL-1β+si-XIST組。

2.3 敲低XIST或PDK1對IL-1β誘導的SW1353細胞炎癥因子的影響

與Control組相比，IL-1β組TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加，IL-4、IL-10水平減小(P<0.05)；與IL-1β組和IL-1β+si-NC組相比，IL-1β+si-XIST組和IL-1β+si-PDK1組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，IL-4、IL-10水平升高(P<0.05)，見表4。

表4 敲低XIST或PDK1對IL-1β誘導的SW1353細胞炎癥因子的影響Table 4 Effects of knockdown of XIST or PDK1 on IL-1β-induced inflammatory factors in SW1353 cells n=6)

2.4 XIST負向調控miR-302a-3p

ENCORI預測顯示miR-302a-3p與XIST存在作用位點，見圖3。miR-302a-3p mimics+WT-XIST組相對熒光素酶活性顯著低于miR-NC mimics+WT-XIST組(P<0.05)，見表5。pc-XIST組miR-302a-3p表達低于pcDNA組，si-XIST組miR-302a-3p表達高于si-NC組(P<0.05)，見表6。

圖3 miR-302a-3p與XIST的作用位點Fig.3 Interaction site between miR-302a-3p and XIST

表5 雙熒光素酶報告基因檢測實驗

表6 XIST負向調控Table 6 XIST negatively regulates miR-302a-3p n=6)

2.5 miR-302a-3p的下調逆轉了si-XIST對IL-1β誘導的SW1353細胞的作用

與IL-1β+si-XIST組和IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組比較，IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組miR-302a-3p表達下降，細胞活力、Bcl-2表達及IL-4、IL-10水平降低，凋亡率、Bax表達及TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升(P<0.05)，見圖4、圖5、表7、表8。

表7 miR-302a-3p的下調逆轉了si-XIST對IL-1β誘導的SW1353細胞增殖、凋亡的作用

表8 miR-302a-3p的下調逆轉了si-XIST對IL-1β誘導的SW1353細胞炎癥因子的作用

注：A：IL-1β+si-XIST組；B：IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組；C：IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組。

2.6 PDK1是miR-302a-3p的靶點

圖6顯示，Targetscan預測顯示miR-302a-3p與PDK1可能存在作用關系。miR-302a-3p mimics+WT-PDK1組相對熒光素酶活性明顯低于miR-NC mimics+WT-PDK1組(P<0.05)，見表9。miR-302a-3p mimics組PDK1 mRNA和蛋白表達低于miR-NC mimics組，miR-302a-3p inhibitor組PDK1 mRNA和蛋白表達高于miR-NC inhibitor組(P<0.05)，見圖7和表10。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖6 miR-302a-3p與PDK1的作用位點Fig.6 The interaction sites of miR-302a-3p and PDK1

注：A：miR-NC mimics組；B：miR-302a-3p mimics組；C：miR-NC inhibitor組，D：miR-302a-3p inhibitor。

表9 雙熒光素酶報告基因檢測實驗Table 9 Dual-luciferase reporter gene assay n=6)

表10 miR-302a-3p靶向調控

2.7 XIST敲低通過促進miR-302a-3p抑制PDK1的表達

IL-1β組PDK1 mRNA和蛋白表達比Control組高(P<0.05)；IL-1β+si-XIST組PDK1 mRNA和蛋白表達比IL-1β組和IL-1β+si-NC組低(P<0.05)；IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組PDK1 mRNA和蛋白表達比IL-1β+si-XIST組和IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組高(P<0.05)，見圖8、表11。

注：A為Control組；B為IL-1β組；C為IL-1β+si-NC組；D為IL-1β+si-XIST組；E為IL-1β+si-XIST+miR-NC inhibitor組；F：IL-1β+si-XIST+miR-302a-3p inhibitor組

表11 XIST敲低通過促進miR-302a-3p抑制PDK1的表達

3 討論

lncRNA在OA發病機制中發揮重要作用。例如，PVT1在OA患者血清中高表達，其缺失可減輕脂多糖誘導的骨關節炎進展[10]。Zhang等[11]通過調節miR-150-5p/AKT3促進IL-1β誘導的軟骨細胞增殖并抑制細胞凋亡。本研究發現XIST在IL-1β處理的SW1353細胞中表達更高，提示XIST可能與OA的進展有關。敲低XIST后細胞活力增強，凋亡受阻，提示IL-1β誘導的細胞凋亡可以通過下調XIST而得到緩解。過度炎癥在IL-1β誘導的軟骨細胞中TNF-α、IL-6等促炎因子表達顯著升高[12]。結果顯示，IL-1β誘導了SW1353細胞的炎癥反應，而XIST的敲低使細胞分泌的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，抗炎因子IL-4、IL-10水平升高，提示下調XIST可抑制IL-1β誘導的炎癥反應。

研究[13-14]表明，XIST通過與miRNA作用發揮其調控功能。在本研究中，miR-302a-3p被證實為XIST的一個miRNA靶點，且XIST負向調控miR-302a-3p的表達。近期研究表明，miR-302a-3p不僅抑制多種癌癥的進展，還在心、腦、腎等相關疾病中發揮作用。Bai等[15]指出，抑制miR-302a-3p可通過靶向抑制FMR1抑制缺氧-復氧誘導的腎小管上皮細胞凋亡。然而并未有報道顯示miR-302a-3p在OA中的作用。本研究發現miR-302a-3p在IL-1β誘導的SW1353細胞中下調，而抑制miR-302a-3p可逆轉XIST敲除對IL-1β誘導的SW1353細胞凋亡、炎癥因子水平的影響，提示XIST敲除對軟骨細胞OA損傷的保護作用是通過促進miR-302a-3p實現的。

作為上游的miRNA通過調控下游基因實現其功能。在本研究中，Targetscan顯示了miR-302a-3p與PDK1 3’UTR序列的互補結合位點。而雙熒光素酶報告基因實驗與qRT-PCR、Western blot聯合確定了PDK1是miR-302a-3p的下游靶基因。PDK1參與許多細胞系的凋亡，并控制了PI3K或其他途徑(如RAS GTPase-MAPK)下游的許多細胞過程[16]。同時，有報道[17]稱PDK1上調促進類風濕關節炎的炎癥進展。本研究發現，PDK1在IL-1β誘導的SW1353細胞中表達升高，由于既往研究[8]顯示了沉默PDK1可抑制體外模擬OA樣軟骨細胞凋亡，故本研究僅檢測了其對炎癥因子的影響，結果發現沉默PDK1可降低促炎因子的分泌而增加抑炎因子的表達，說明PDK1能促進OA進展。此外，抑制miR-302a-3p可使XIST敲低對PDK1的抑制作用得到緩解，提示XIST在OA中的作用是通過miR-302a-3p/PDK1軸實現的。然而，PDK1能否挽救miR-302a-3p對OA的影響尚不清楚，這將是本研究接下來的重點。

綜上所述，抑制XIST通過靶向上調miR-302a-3p進而抑制PDK1表達的作用促進了IL-1β處理的軟骨細胞的細胞活力，但抑制了凋亡和炎癥反應的發生，這為XIST/miR-302a-3p/PDK1調控軸在OA進展中的存在提供了證據，也在lncRNA領域中XIST作為一種有前途的分子生物標志物為OA治療提供了新的方向。