雞冠花黃酮對骨質疏松大鼠TMAO/NF-κB/NFATc1水平的影響

鄧滿香 陳鷺玲 何劍全

廈門大學附屬中山醫院，福建 廈門 361000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量降低，骨微結構破壞骨脆性增加的全身性疾病[1-2]。骨微結構主要受到骨代謝的影響，可參與骨重建，具有維持骨結構及功能完整性的作用[3]。OP患者存在骨微結構改變，表現為成骨細胞分化及聚集降低、骨小梁分布降低、骨脆性增加、提高骨折發生風險。骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BAP)是由成骨細胞分化而成，可增加羥磷灰石沉積，抑制骨鹽形成，是反映成骨細胞活性及骨形成的敏感指標[4]。氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)是存在于血液循環中和慢性腎病及心腦血管疾病關系密切的指標。以往文獻[5]證實，糖尿病腎病患者血清中TMAO表達升高并隨著疾病加重而升高，但與OP疾病水平暫無研究。核因子Kappa B (nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種具有生物調節作用的蛋白質，能夠介導炎癥反應、細胞生物活性及免疫應答等，在OP時表達升高可促進骨炎癥反應[6]。活化T細胞核轉錄因子c1 (nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, NFATcl)是重要轉錄因子，在破骨細胞中可結合上游信號通路提高破骨細胞活性及提高骨基質的降解作用[7]。

雞冠花(Celosia cristata L)為莧科草本植物，其性溫、無毒，藥理作用具有收澀、止血、止帶扽功效。近些年，國內外大量學者對雞冠花的有效成分進行分析，其黃酮類活性物質更為豐富，具有抗衰老、抗腫瘤、提高免疫能力及抗骨質疏松等作用[8]。本文通過建立老年OP大鼠，觀察雞冠花黃酮提取物對骨微結構、骨特異性磷酸酶及TMAO-NF-κB/NFATc1水平的影響，為OP臨床用藥提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗大鼠

50只SPF級SD雄性大鼠，16周齡，購自廣東省醫學實驗動物中心，平均體重300～350 g，許可證號：SCXK(粵)2020—0028，在常溫下濕度為55%下分籠喂養，5只1籠。所有涉及動物的操作嚴格遵循實驗動物倫理要求。模擬黑白交替無菌飲食2周及按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2 主要材料與方法

4 %多聚甲醛(Sigma-Aldrich Inc，USA)；0.9 %生理鹽水(中國大冢制藥有限公司)；兔抗TMAO；NF-κB, NFATc 1抗體(Cell Singal Technology，美國)；GAPDH抗體(Proteintech，美國)；伊紅-蘇木精染色液(杭州華東醫藥有限公司)；自動生化分析儀(Au5400 Beckman Coulter Inc., Massachusetts CA, USA)；普通顯微鏡(Olympus, Japan)；蛋白電泳儀(北京六一儀器)。

1.3 雞冠花黃酮提取物制備

我院微生物與免疫學教研室于2020年10月中下旬采收普通雞冠花的花序；除去種子和莖梗，烘干后粉碎備用。乙醚回流抽提7 h，脫脂后的樣品再用95 %乙醇于65 ℃水浴上提取6 h，蒸發干燥得粉劑，溶解后再過濾除菌。

1.4 分組、OP模型制備及干預方法

將大鼠隨機分為Sham組、模型組、干預組及藥物對照組，術前禁食12 h、禁水6 h，1 %戊巴比妥鈉麻醉，用量4 mg/kg，四肢刺激無反應，麻醉成功。于兩側肋下剃毛，消毒后，在肋下2 cm脊柱旁1.5 cm作縱向開口，腹腔內找到菜花樣卵巢組織結扎并切除，無活動出血后將周圍組織塞入腹腔并縫合皮膚，Sham組保留卵巢切除周圍脂肪組織，依次縫合切口，加壓包扎，術后常規皮下注射青霉素1萬U/d，連用3 d，預防感染。采集陰道分泌物進行涂片檢查，鏡檢脫落細胞密集者為去勢成功。去勢成功且血鈣和雙側脛骨骨密度明顯低于Sham組，為老年骨質疏松模型制備成功。剔除死亡大鼠6只。Sham組、模型組、干預組及藥物對照組分別為13只、模型組9只、干預組11只、藥物對照組11只。干預組采用雞冠花黃酮提取物100 mg/(kg.d)灌胃，藥物對照組采用0.3 g/kg的鈣爾奇碳酸鈣D3片，其余大鼠均灌胃等體積0.9 %的生理鹽水，每日灌胃1次，連續干預16周。

1.5 血清Ca、P、ALP及BAP水平

收集大鼠尾部靜脈血2 mL，加入無抗凝劑的試管中，離心分離沉淀的血清以4 000 r/min 10 min，檢測上清液中鈣(Ca)、磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)及骨特異性堿性磷酸酶(BAP)水平。

1.6 micro CT測量股骨骨微結構及骨密度

干預后，麻醉處死大鼠，分離雙側股骨組織，采用手術刀剃凈股骨大分布組織，將左側股骨放入浸泡于10 %福爾馬林固定，用于骨微結構micro CT分析，分組股骨組織骨密度(BMD)利用該系統軟件進行分析并經自動統計給出結果。

1.7 HE染色檢測組織病理形態

組織浸入10 %的甲醛溶液，固定過夜，自來水沖洗，浸泡于14 %的EDTA溶液中脫鈣，逐級脫水經石蠟包埋后4 μm切片后備用。各組股骨組織切片放入37 ℃復溫15 min，二甲苯脫蠟后按照100 %-95 %-85 %及75 %乙醇-100 %蒸餾水進行逐級水化，蘇木精染色10 min，鹽酸(1%)處理，伊紅復染，梯度乙醇脫水，封片后觀察組織形態。

1.8 免疫組化檢測TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達

股骨組織剪切成小塊，脫水、包埋后，采用甲醛固定，水化后，37.5 ℃靜置后0.5 h后，加入1 % 的EDTA液，山羊血清封閉。加入TMAO抗體(1∶500)、NF-κB(1∶700)及NFATc1(1∶1000)抗體，加入二抗0.5 h后，復染，封片。以淡黃色至棕褐色，為陽性，隨機選取每一張免疫組化切片的5個視野，并用MIAS醫學圖像分析系統進行分析。

1.9 免疫印跡檢測TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白表達

股骨組織加入胰蛋白裂解液，離心后采取上清液加入樣孔。進行電泳，PVDF膜TBS浸泡10 min，反復PBS沖洗，5 min/次，分別加入TMAO抗體(1∶1 000)、NF-κB(1∶800)及NFATc1(1∶1 500)抗體、過加入抗兔IgG二抗(1∶2 000)，雜交5 min采用PBS沖洗3次，后放入ECL工作液中，隨后進行檢測，獲取圖象。

1.10 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平比較

與Sham組相比，模型組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平均降低(P<0.05)，與模型組相比，干預組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平升高(P<0.05)；干預組與藥物對照組上述指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平比較Table 1 Comparison of serum Ca, P, ALP and BAP levels in each

2.2 各組大鼠骨微結構及骨密度比較

Sham組股骨組織中骨小梁多呈現板狀，致密均勻。模型組大鼠股骨組織骨小梁稀疏，與模型組大鼠股骨組織相比，干預組及藥物對照組大鼠股骨組織骨小梁數量、骨小梁連接密度均提高，見圖1。Sham組、模型組、干預組及藥物對照組的骨密度BMD分為(58.05±6.11)mg/cm3、(47.50±4.53)mg/cm3、(55.17±5.14)mg/cm3及(54.96±5.40)mg/cm3，組間比較差異具有統計學意義(F=6.983，P<0.001)，與Sham組比較，模型組BMD降低(P<0.05)，與模型組相比，干預組BMD升高(P<0.05)，干預組和藥物對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖1 各組大鼠骨微結構比較Fig.1 Comparison of bone microstructure in each group

注：與Sham組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.3 HE染色觀察各組大鼠股骨組織病理形態

Sham組大鼠股骨形態飽滿，排列整齊無斷層，骨小梁形態連續，未見空洞。模型組骨小梁組織變細，骨小梁出現斷裂及不連續，骨基質紊亂分布，骨密質間斷裂及較多空洞形成。干預組及藥物對照組骨小梁組織逐漸改變，排列緊致，骨基質紊亂改善空洞減少。見圖3。

圖3 各組大鼠股骨組織形態比較(50×)Fig.3 Comparison of the morphology of femur in each group (50×)

2.4 免疫組化檢測各組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達

與Sham組相比，模型組大鼠股骨組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達較高(P<0.05)，與模型組相比，干預組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，干預組和藥物對照組上述指標之間差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖4。

圖4 各組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達Fig.4 Positive expression of TMAO, NF-κB and NFATc1 in each group

表2 各組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達

2.5 免疫印跡檢測各組大鼠TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白水平

與Sham組相比，模型組大鼠股骨組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達較高(P<0.05)，與模型組相比，干預組大鼠組織中TMAO、NF-κB、NFATc1陽性表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，干預組和藥物對照組上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白水平

3 討論

鈣和磷都是人體必需元素，99 %的鈣均是以羥基磷灰石結晶形式儲存在骨組織中，1 %的鈣主要分布在體液及軟組織中，可參與凝血及肌肉收縮等作用。80 %磷以磷酸鈣的形式儲存在骨組織中，磷可輔助鈣共同調控機體生理功能[9-10]。ALP主要表達在骨鈣化區域，聯合水解酶作用磷酸酯釋放鈣以沉淀方式附著于膠原骨架上，有利于成骨。BAP是由肝臟及成骨細胞合成，在成骨過程中可水解成磷酸脂，其表達升高有利于骨形成[11]。本文研究表示，干預組大鼠血清Ca、P、ALP及BAP水平均高于模型組，說明雞冠花黃酮提取物可通過增加OP骨代謝指標而改善骨質疏松。相關研究[12]證實，植物雌激素可有效抑制絕經后骨量丟失，黃酮類物質已經被證實增加骨質量而增加骨形成。雞冠花黃酮是從雞冠花中提取的有效活性成分，對OP中血鈣及血麟具有調節作用，可通過減少骨鈣修飾而改善OP。Cho等[13]研究表示，雞冠花生物學功能廣泛，可增加骨密度而減少鈣流失的同時，通過體外成骨細胞實驗，發現雞冠花黃酮提取物可通過增加成骨細胞活性而增加礦化能力。因此本文推測雞冠花黃酮提取物可能是通過增加成骨細胞活性，提高骨質量而增加BAP表達。

圖5 各組大鼠TMAO、NF-κB、NFATc1蛋白水平Fig.5 Protein levels of TMAO, NF-κB and NFATc1 in each group

本文采用Micro CT對各組大鼠股骨組織骨小梁進行三維結構重建，可對骨小梁厚度、間距及體積進行分析，可通過獲得骨參數可預測骨強度。BMD表示骨密度，是骨骼強度的重要指標。謝菲爾德大學學生健康中心認為BMD水平降低是導致OP疾病發生的主要原因，也是合并骨折發生的危險因素[14]。國際學者研究表明，在OP大鼠中采用雙能X線骨密度檢測儀器能夠通過評估BMD含量而反映OP改善程度[15]。黃酮類化合物及衍生物對可被用來抗骨質疏松，雞冠花黃酮提取物抗OP主要機制在于可增加成骨細胞活性，提高骨密度增加骨形成量，還可通過減少破骨細胞募集而改善骨吸收，還可通過加快骨膠原合成及基質礦化而發揮抗OP作用。李萬里等[16]研究表示，在成骨細胞體外實驗中采用雞冠花黃酮提取物培養后，IGF-1表達升高說明雞冠花黃酮提取物可增加成骨細胞活性而增加骨小梁厚度發揮預防OP的作用。

本文研究表示，干預組大鼠股骨組織中TMAO、NF-κB、NFATc1表達均低于模型組，說明雞冠花黃酮提取物可抑制TMAO、NF-κB、NFATc1水平抑制老年OP。TMAO屬于一類促炎性反應因子，在糖尿病及腎臟疾病中TMAO升高可增加氧化應激反應[17]。慢性腎臟疾病可導致人體礦物質及骨狀態發展改變，可增加患者OP發生及骨折發生風險，TMAO升高可加重糖尿病腎病發生發展而加快OP形成，因此抑制其表達可一定程度上發揮骨保護作用。OP發生時氧化應激持續激活可增加NF-κB表達，可與 TNF-α 受體(TNFR) 結合后增加骨基質細胞分泌因子κB 受體活化因子受體配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL) 及巨噬細胞集落刺激因子等，促進破骨細胞的增殖、分化，抑制其凋亡，增強其骨吸收能力[18]。NFATcl是破骨細胞形成及分化過程中必不可少的調節因子，當其被敲除后采用RANKL刺激后破骨細胞無法分化，說明NFATcl對于破骨細胞形成及功能發揮中具有重要作用[19]。黃酮類提取物可對NF-κB及其受體RANKL發揮抑制作用，例如補骨脂異黃酮可通過抑制NF-κB激活而減少破骨細胞分化而增加成骨細胞活性而減少骨量丟失，對OP發揮改善作用。雞冠花還有豐富的黃酮類化合物，可發揮抗炎癥、抗氧化應激及抗OP作用。李萬里等[20]研究表示，雞冠花黃酮提取物對氟中毒骨代謝異常大鼠可通過改善骨代謝紊亂，降低炎癥反應而提高骨密度，促進骨形成。本文推測雞冠花黃酮提取物可通過發揮強大抗炎癥作用而抑制NF-κB及其受體RANKL表達，降低破骨細胞活性而預防OP發生發展。

本文研究存在一定不足，未建立不同濃度的雞冠花黃酮提取物組別，時間及經費受限，可能影響實驗結果。今后加強與其他單位聯合增加實驗方法和實驗結果，為老年OP治療提供實驗依據。綜上所述，老年骨質疏松大鼠采用雞冠花黃酮提取物干預后可顯著改善骨微結構，提高骨特異性磷酸酶活性增加骨密度，機制可能與抑制TMAO、NF-κB、NFATc1表達相關。