復方腸泰方通過抑制Akt/mTOR/p70S6K通路誘導CT26細胞自噬的研究

劉芮奇，李靈常，崔莉，孫娥?

（1.南京中醫藥大學第三臨床醫學院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京 210028）

結腸癌是我國常見的惡性腫瘤，近年來，我國結腸癌的患病率和病死率逐年增加。最新中國癌癥統計報告顯示，結腸癌患病率在惡性腫瘤中位居第三，病死率在惡性腫瘤中位居第五［1］，其中新發病例37.6萬例，死亡病例19.1 萬例，已經嚴重威脅到人們的生命健康。結腸癌的早期癥狀不明顯，發現時多是中晚期［2］，因此，深入研究結腸癌的防治具有重要意義。目前臨床上常用于治療結腸癌的化療藥物有奧沙利鉑、氟尿嘧啶、伊立替康和卡培他濱等，但是較強的胃腸道副作用和神經毒性嚴重影響患者的生活質量。

中藥治療結腸癌不但能抑制結腸癌細胞增殖，抑制誘發結腸癌基因表達，抑制轉移瘤生長，還能提高患者免疫力，改善結腸癌術后不良反應［3］。復方腸泰方是江蘇省中西醫結合醫院霍介格教授的經驗方，由人參、黃芪、藤梨根、八月札、苦參、薏苡仁組成，長期應用于臨床治療結腸癌。前期研究發現，與單純FOLFOX4方案化療相比，復方腸泰方聯合FOLFOX4可減輕化療引發的毒性，從而提高治療效果［4-5］。復方腸泰方還具有抗小鼠結腸癌血管生成作用［6］。本研究進一步探討復方腸泰方是否可通過誘導結腸癌細胞產生自噬，實現促癌細胞死亡的作用。

自噬又被稱作Ⅱ型程序性死亡，在多種癌癥中發揮作用，通過促進致癌分子的降解，最終阻止癌癥的發展［7］。參與自噬調節的主要通路包括Akt/mTOR/p70S6K 信號通路和Ras/Raf－1/（MEK1/2）/（ERK1/2）通路，兩者都與腫瘤發生密切相關［8］。本文將研究復方腸泰方對CT26細胞增殖和自噬的影響，并探討其產生自噬是否與Akt/mTOR/p70S6K 信號通路有關，為復方腸泰方的進一步開發與應用提供理論基礎。

1 材料

1.1 細胞株

小鼠結腸癌CT26細胞，購自美國模式菌種收集中心（ATCC），保存于江蘇省中醫藥研究院中藥制劑研究室。用含10%胎牛血清的RPMI－1640 不完全培養液于37 ℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中培養。

1.2 實驗藥物及試劑

RPMI－1640 不完全培養液（批號：20210114）、胰蛋白酶（批號：20200731）、MTT 細胞增殖檢測試劑盒（20210705）、細胞自噬染色檢測試劑盒（批號：20210312），均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；四季青無噬菌體低內毒素優級胎牛血清（南京基遠生物科技有限公司，批號：21020702）；雷帕霉素（上海碧云天生物技術有限公司，批號：092220201231）；人參、黃芪、藤梨根、八月札、苦參、薏苡仁均由江蘇省中西醫結合醫院中藥房提供，經江蘇省中醫院黃然主管中藥師鑒定，均符合相關標準；抗體LC3（批號：BS－8878R）、Beclin－1（批號：BSM－33323M）、Akt1+2+3（批號：BS－6951R）、mTOR（批號：BS－1992R）、p70S6K（批號：BS－1426R）、p－Akt（批號：BSM－33281M），均購自北京博奧森生物技術有限公司；pmTOR（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BM4840）；p－p70S6K（美國CST公司，批號：9234T）。

1.3 主要儀器

電子天平（瑞安市英衡電器有限公司，YHC1002）；調溫電熱套（北京市光明醫療儀器有限公司，DZTW）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠，RE－5203）；真空滅菌鍋（廣州市深華生物技術有限公司，GI80DP）；數顯恒溫攪拌循環水箱（常州國華電器有限公司，HH－60）；生物安全柜（蘇州賽默飛世爾儀器有限公司，1300 系列Ⅱ級）；臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，TDL－40B）；倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司，XDS－1B）；CO2細胞培養箱（Thermo Forma 公司，HERAcell150）；-80 ℃冰箱（Thermo Forma 公司，-86 ℃ULT Freezer）；熒光倒置顯微鏡（南京奧力科學儀器有限公司，Olympus Ⅸ73）；透射電鏡（日本電子株式會社，JEM－1400）；酶標儀（上海美谷分子儀器有限公司，Spectra max 190）。

2 方法

2.1 復方腸泰方的制備

復方腸泰方處方：人參9 g，黃芪15 g，藤梨根15 g，八月札9 g，苦參6 g，薏苡仁20 g。用10 倍體積水浸泡藥材0.5 h，大火煮沸后小火煎煮1 h，藥液趁熱經100目篩網過濾，濾渣再加8 倍體積水煎煮1 h，過濾，放冷，合并兩次濾液，旋轉蒸發儀濃縮至生藥量為2.5 g/mL。用培養基稀釋復方腸泰方溶液，超聲30 min，10 000 r/min 離心10 min，上清液用0.22 μm 無菌濾膜過濾除菌。

2.2 MTT法檢測細胞存活率

在96 孔板中，設置空白對照組以及不同濃度復方腸泰組（10、20、40、70、80、90 mg/mL），每組6 個復孔。將CT26 細胞以5×103個/孔的數量接種于96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中培養。待細胞生長至80%密度，吸出原培養基，加入100 μL 不同濃度藥物。培養24 h 后每孔加入50 μL MTT 溶液，在37 ℃下孵育，4 h 后MTT 還原為甲臜。吸出上清液保留底部藍紫色結晶，每孔加入150 μL DMSO，平板搖床搖勻10 min 使甲臜充分溶解。酶標儀在490 nm 波長處檢測每孔吸光度。

2.3 透射電鏡觀察細胞中自噬體

CT26 細胞以2×105個/孔的數量接種于6 孔板中，細胞長到80%匯合度后，吸出原培養基，加入80 mg/mL復方腸泰方溶液孵育24 h。培養基終止消化，2 000 r/min離心2 min，棄細胞上清。PBS洗滌3次后轉移至1.5 mL EP 管中，離心去除PBS。輕輕加入1 mL 2.5%戊二醛，室溫固定至少2 h，然后進行包埋固化切片，3%醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察細胞中自噬體并拍照記錄。

2.4 MDC法檢測細胞中自噬體

用MDC 法對自噬體進行染色。24 孔板中放入與其等體積的細胞爬片，CT26 細胞以5 × 104個/孔的數量接種于24 孔板中，細胞長到80%匯合度后，吸出原培養基。設置空白對照組以及低、中、高濃度（20、40、80 mg/mL）復方腸泰組，干預細胞24 h。棄原培養液，加入300 μL 1 × Wash bufffer 洗2 次，然后每孔加入100 μL MDC 工作液，室溫避光染色30 min 后棄染液，每孔加入300 μL 1 × Wash bufffer 洗3 次。取出爬片，

有細胞一面滴20 μL 抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察細胞被染色情況并拍照記錄。

2.5 自噬誘導劑雷帕霉素

設置空白對照組、80 mg/mL 復方腸泰組和復方腸泰+雷帕霉素組。將CT26 細胞以5 × 103個/孔的數量接種于96 孔板中，每組6 個復孔。待細胞生長至80%匯合度，復方腸泰+ 雷帕霉素組用自噬誘導劑50 nmol/L 雷帕霉素與80 mg/mL 復方腸泰方溶液共同干預細胞，孵育24 h后，用熒光倒置顯微鏡拍攝不同組的細胞狀態。然后使用MTT 法評估CT26 細胞的存活率。

2.6 蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白表達

CT26 細胞以1×105個/孔的數量接種于6 孔板中，細胞長到80%匯合度后，吸出原培養基，分別加入低、中、高濃度（20、40、80 mg/mL）復方腸泰方溶液孵育。24 h 后用胰酶消化細胞，培養基終止消化，2 000 r/min離心2 min，PBS洗滌3次，去上清得細胞沉淀。加入沉淀體積5 倍的裂解液，將沉淀吹散，4 ℃裂解1 h，超聲破碎儀破碎，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液。BCA 法用于確定蛋白質量濃度，將上樣液于100 ℃水中煮沸5 min 使蛋白質變性，冰上驟冷，SDS－PAGE 電泳分離后轉移至PVDF 膜上，轉膜結束后，用5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，封閉后，與一抗在4 ℃下孵育過夜，回收一抗，二抗室溫搖床振蕩反應2 h。ECL 發光顯色。

2.7 統計學方法

采用Graphpad Prism 6 統計軟件處理。計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析（One－way ANOVA），兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05代表差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 CT26細胞增殖情況比較

不同濃度復方腸泰方溶液（10、20、40、70、80、90 mg/mL）處理CT26細胞24 h后，MTT檢測結果顯示，與空白對照組相比，10、20、40 mg/mL 濃度的復方腸泰方對細胞增殖影響較小。當復方腸泰方濃度增至80 mg/mL 時，細胞存活率為50%左右，且隨著濃度的增加，增殖抑制效果增強。見表1。為確保復方腸泰方對CT26 細胞有增殖抑制作用且能進行后續實驗相關指標的檢測，故選用低、中、高劑量的復方腸泰方溶液（20、40、80 mg/mL）進行后續研究。

表1 各組對CT26細胞增殖的抑制作用比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05，***P ＜0.001，****P ＜0.000 1。

組別空白對照組復方腸泰組濃度（mg/mL）0 10 20 40 70 80 90存活率（%）100.00 93.62±4.12 95.53±6.71 96.30±5.08 72.53±3.98*47.04±2.37***29.78±0.65****

3.2 CT26細胞產生自噬情況比較

透射電鏡結果見圖1，與空白對照組相比，80 mg/mL 濃度的復方腸泰方溶液干預細胞后可以看到類似自噬溶酶體結構，放大后能看到自噬體中被降解的細胞器。MDC 使自噬體在熒光顯微鏡下發出藍綠色熒光，結果見圖2。低、中、高劑量復方腸泰方溶液干預CT26細胞后，細胞熒光強度顯著增強，50 nmol/L雷帕霉素組細胞熒光強度最高。自噬體只是檢測自噬的單一指標，為進一步驗證復方腸泰方是否誘導CT26細胞產生自噬，使用蛋白質印跡法檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin－1 蛋白表達水平，結果見圖3、表2。與空白對照組相比，中、高劑量復方腸泰方溶液干預CT26 細胞后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達升高。Beclin－1 蛋白表達隨復方腸泰方給藥濃度增加而增加（P＜0.05），說明復方腸泰方可以誘導CT26產生自噬。

表2 CT26細胞自噬相關蛋白表達的比較（±s）

表2 CT26細胞自噬相關蛋白表達的比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別空白對照組復方腸泰組濃度（mg/mL）0 20 40 80 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.82±0.04 0.69±0.06 0.90±0.07 0.88±0.03 Beclin－1/GAPDH 0.40±0.08 0.74±0.10*0.86±0.13**1.01±0.18**

圖1 透射電鏡觀察CT26細胞內自噬溶酶體

圖2 MDC染色法檢測CT26細胞自噬體（×200）

圖3 不同濃度復方腸泰方對CT26細胞自噬相關蛋白表達的影響

3.3 自噬誘導CT26細胞存活率情況比較

雷帕霉素可通過抑制mTOR通路，誘導和促進細胞自噬的發生。用自噬誘導劑雷帕霉素干預細胞，用倒置顯微鏡觀察細胞生存狀況，結果見圖4。空白對照組細胞伸展良好，邊界清晰；80 mg/mL濃度復方腸泰干預后，貼壁細胞數減少，細胞少量皺縮，少數細胞從伸展狀態變為圓形狀態；80 mg/mL濃度復方腸泰+50 nmol/L濃度雷帕霉素干預后，細胞皺縮嚴重，貼壁細胞數少。MTT法檢測CT26細胞存活率，結果與空白對照組相比，復方腸泰方抑制了CT26細胞增殖，復方腸泰+雷帕霉素使CT26細胞的病死率增加。見表3。

圖4 自噬誘導劑對復方腸泰方作用的CT26細胞形態的影響（×100）

表3 自噬誘導CT26細胞存活率的比較（±s）

表3 自噬誘導CT26細胞存活率的比較（±s）

注：與空白對照組比較，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

組別空白對照組復方腸泰組復方腸泰+雷帕霉素組濃度（mg/mL）0 80 80存活率（%）100.00 57.30±5.22**26.31±2.18***

3.4 對Akt/mTOR/p70S6K通路影響的比較

采用蛋白質印跡法檢測Akt/mTOR/p70S6K通路的相關蛋白表達。結果發現，p－Akt、p－mTOR和p－p70S6K與自噬呈負相關。與空白對照組相比，低、中、高劑量復方腸泰干預CT26細胞后，p－Akt/Akt、p－mTOR/mTOR和p－p70S6K/p70S6K的蛋白表達降低（P＜0.05）。結果表明復方腸泰方可能通過抑制Akt/mTOR/p70S6K通路，誘導CT26細胞產生自噬。見表4、圖5。

圖5 不同濃度復方腸泰方對CT26細胞Akt/mTOR/p70S6K通路相關蛋白表達的影響

表4 各組對CT26細胞Akt/mTOR/p70S6K通路相關蛋白表達的影響（±s）

表4 各組對CT26細胞Akt/mTOR/p70S6K通路相關蛋白表達的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別空白對照組復方腸泰組濃度（mg/mL）0 20 40 80 p－Akt/Akt 0.99±0.13 0.75±0.07*0.38±0.03**0.17±0.01**p－mTOR/mTOR 0.77±0.07 0.80±0.02 0.59±0.15 0.24±0.09*p－p70S6K/p70S6K 1.33±0.16 0.76±0.08*0.55±0.06*0.26±0.02**

4 討論

結腸癌屬“腸覃”“腸癖”“臟毒”等范疇［9］。中醫學認為，結腸癌的形成是由于人體正氣不足，外邪侵襲脾胃，導致脾失健運，氣血津液運行失常，水濕停聚，積久形成瘀、毒、濕熱。故治療結直腸癌應以補益氣血、驅邪外出為原則，以健脾益氣、化瘀解毒為治療方法［10］。復方腸泰方按照健脾益氣、化瘀解毒的治療原則，由人參、黃芪、藤梨根、八月札、苦參、薏苡仁組成。方中人參補脾益肺、扶正培本；薏苡仁健脾寧心、利水滲濕；黃芪補氣、益衛固表；苦參瀉火解毒；藤梨根清熱解毒、祛風除濕；八月札疏肝理氣、活血止痛。全方配伍，共奏補益正氣、健脾利濕、清熱解毒、活血化瘀之功。一方面直接補益正氣提高人體免疫力，另一方面驅除損害人體正氣的病邪［11］。

復方腸泰方的抗癌作用可能是通過抑制癌細胞的增殖實現的。實驗表明，10 ～60 mg/mL復方腸泰方對細胞的增殖作用影響較小，細胞存活率在90%左右。但當復方腸泰方濃度增至70 mg/mL 時，細胞存活率降至70%，且隨著濃度的增加，增殖抑制作用增強。

本研究進一步探索了復方腸泰方抑制癌細胞增殖是否與自噬相關，結果發現，復方腸泰方干預CT26細胞后，可觀察到自噬小體和自噬相關蛋白表達的增加。僅中、高劑量的復方腸泰方增加了CT26 細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平，提示復方腸泰方的濃度與自噬的發生密切相關，今后仍需在后續研究中擴大復方腸泰方濃度范圍來繼續探索其誘導自噬的規律。自噬已被確定為腫瘤細胞存活和抵抗的潛在機制，一方面可以阻止致癌蛋白如p62 以及受損蛋白和細胞器的積累起到抑制腫瘤作用［12］，另一方面，在晚期腫瘤或癌癥治療期間，自噬可以作為細胞防御機制發揮作用，使腫瘤細胞能夠在缺氧和代謝應激等惡劣條件下存活［13］。這說明自噬對腫瘤細胞的作用具有雙重性，自噬既可以誘導細胞死亡又可以在缺氧等惡劣環境下促使腫瘤細胞存活。然而復方腸泰方誘導CT26細胞產生的自噬與腫瘤細胞死亡的關系尚不明確，因此筆者采用自噬誘導劑雷帕霉素干預CT26細胞，結果發現復方腸泰+雷帕霉素組細胞存活率為26%，而復方腸泰組細胞存活率為57%，兩者差異具有統計學意義，提示誘導產生的自噬促進了CT26細胞的死亡。綜上，復方腸泰方可通過誘導CT26細胞產生自噬，促使細胞死亡，從而達到抗結腸癌作用。

自噬相關通路可調控細胞增殖、生長、代謝和運動。PI3K 激酶是最上游的分子，作為自噬信號級聯的觸發器，磷酸化Akt 能抑制TSC1/2 導致mTORC1 激活［14］。mTORC1通過磷酸化使形成的自噬調節復合物失活，從而抑制自噬小體的發生。p70S6K 靶點作為mTOR 的下游，可以被mTOR 通路激活。因此Akt/mTOR/p70S6K 通路與自噬的發生密切相關，通過抑制此通路調節自噬可為多種疾病的治療提供策略［15］。研究表明，小檗堿可以通過抑制mAPK/mTOR/p70S6K 信號通路誘導細胞抑制性自噬，從而抑制人胃癌細胞的體內、外生長［16］。紅景天苷通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導人大腸癌細胞凋亡和自噬［17］。本研究同樣發現，復方腸泰方干預CT26細胞后，Akt、mTOR 和p70S6K 蛋白的磷酸化水平降低。說明復方腸泰方可能通過抑制Akt/mTOR/p70S6K 通路誘導結腸癌細胞發生自噬。

綜上所述，復方腸泰方可通過抑制Akt/mTOR/p70S6K 通路誘導結腸癌細胞自噬，進而抑制癌細胞增殖，發揮抗結腸癌作用，本研究可為臨床開發治療結腸癌確有療效的復方制劑奠定基礎。