星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2作為癲癇治療靶點的探討

霍曼，楊志華，崔潤芝，趙志英，李怡霏，石玉蛟

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

癲癇是由于興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞不平衡導(dǎo)致的大腦神經(jīng)元群體異常同步放電而引起的，是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，全世界至少有6 500 萬人受其影響［1］。癲癇發(fā)作的最初損傷后，會有長達(dá)數(shù)年的潛伏期，在此期間會發(fā)生復(fù)雜的分子及生化結(jié)構(gòu)的變化，包括離子通道改變、神經(jīng)元死亡、炎癥級聯(lián)反應(yīng)激活、膠質(zhì)增生等，最終導(dǎo)致神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)更容易超興奮，這些興奮性神經(jīng)元的同步放電，導(dǎo)致更多的癲癇發(fā)作［2］。可用的抗癲癇藥物（AEDs）主要通過調(diào)節(jié)離子通道、增強抑制性神經(jīng)傳遞或減弱興奮性神經(jīng)傳遞來靶向神經(jīng)元，但具有藥物耐藥性［3］。由于神經(jīng)傳遞的調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致劑量依賴性的“神經(jīng)毒性”副作用，這也是使用AEDs常見的不良反應(yīng)，AEDs對認(rèn)知和行為的影響會導(dǎo)致多達(dá)1/3的患者停用AEDs，而目前臨床廣泛使用的AEDs只能抑制神經(jīng)元的過度興奮性，但不會削弱疾病的發(fā)生和發(fā)展過程［4］。對于社會來說，癲癇患者需要終身護(hù)理，造成了社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)；對于個人來說，疾病可能使患者感到羞恥，增加患者心理負(fù)擔(dān)。因此，進(jìn)一步研究具有較少副作用和削弱疾病發(fā)展的非神經(jīng)元靶點至關(guān)重要。研究表明，谷氨酸興奮性毒性引起的神經(jīng)元死亡可能是癲癇發(fā)作的原因，而星形膠質(zhì)細(xì)胞異常釋放谷氨酸參與了癲癇發(fā)生過程中初始損傷的分子機制［5－6］。筆者通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，進(jìn)行總結(jié)歸納，一方面將癲癇發(fā)病與星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2的相關(guān)性進(jìn)行系統(tǒng)闡述，另一方面將EAAT2作為治療癲癇的重要靶點，以期為癲癇的治療方面提供新的方向。

1 星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸在癲癇發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用

星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte）是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣泛的一類細(xì)胞，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，在癲癇的病理、生理中發(fā)揮重要作用［7］。星形膠質(zhì)細(xì)胞具有許多突起，伸展填充在神經(jīng)細(xì)胞的胞體及其突起之間，起到支持和分隔神經(jīng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅作為“黏合劑”將神經(jīng)元結(jié)合在一起，而且在大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著關(guān)鍵作用［8］。主要參與細(xì)胞外水和離子穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞外空間容量，清除神經(jīng)遞質(zhì)，抑制神經(jīng)興奮性毒性，能量供應(yīng)和代謝等［9－10］。雖然星形膠質(zhì)細(xì)胞有許多保護(hù)大腦免于過度興奮的過程，但星形膠質(zhì)細(xì)胞功能失調(diào)可能導(dǎo)致過度興奮或通過多種機制促進(jìn)癲癇的發(fā)生，在癲癇發(fā)作前和發(fā)作期間的病理、生理條件下，異常的星形細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和星形細(xì)胞功能的改變在癲癇的發(fā)展中起到重要作用［11］。

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性神經(jīng)元釋放的最常見的神經(jīng)遞質(zhì)，殘留在細(xì)胞外間隙的谷氨酸有潛在的神經(jīng)毒性，突觸傳遞過程中未使用的谷氨酸必須從細(xì)胞外空間迅速清除。谷氨酸清除的任務(wù)主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞完成，并由谷氨酸轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的基本功能之一是吸收大部分突觸釋放的谷氨酸，從而優(yōu)化神經(jīng)元的功能，并防止谷氨酸興奮性毒性［12］。癲癇發(fā)作伴隨著興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之間的失衡，而谷氨酸作為大腦主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在癲癇發(fā)作活動的起始以及發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸濃度的增加與癲癇活動強度呈正相關(guān)，細(xì)胞外谷氨酸水平的增加在癲癇發(fā)作中至關(guān)重要［13］。

2 EAAT2對谷氨酸穩(wěn)態(tài)的影響

谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（EAAT）是一種二級活性轉(zhuǎn)運體，它結(jié)合了一個谷氨酸與3 個Na+和1 個H+，以及1 個K+的反向轉(zhuǎn)運。星形膠質(zhì)細(xì)胞吸收的谷氨酸經(jīng)谷氨酰胺合成酶轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，然后轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外空間，在那里被突觸前神經(jīng)元吸收，再經(jīng)谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)化回谷氨酸。然后谷氨酸通過囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體被包裝到突觸囊泡中［14］。到目前為止，共鑒定出5 種EAAT 亞型，分別是EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4 和EAAT5。人類的前兩種亞型，EAAT1和EAAT2在小鼠中分別被稱為谷氨酸－天冬氨酸轉(zhuǎn)運體（GLAST）和谷氨酸轉(zhuǎn)運體－1（GLT－1），主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。EAAT3（興奮性氨基酸載體，EAAC1）由神經(jīng)元胞體表達(dá)。EAAT4 由小腦浦肯野細(xì)胞表達(dá)，EAAT5 僅在視網(wǎng)膜中表達(dá)［15－16］。本文將重點介紹EAAT2，它是EAAT 中最豐富的亞型，在整個大腦和脊髓中都有表達(dá)。EAAT2主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中約占總谷氨酸轉(zhuǎn)運活動的95%。因此，EAAT2 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中扮演著維持谷氨酸穩(wěn)態(tài)的中心角色，從而發(fā)揮預(yù)防興奮性毒性的作用［17］。

首次證明谷氨酸濃度升高將導(dǎo)致癲癇發(fā)作是來自1989—1992年對癲癇患者海馬GABA和谷氨酸濃度的體內(nèi)微透析研究結(jié)果。研究人員發(fā)現(xiàn)，在癲癇發(fā)作前1.5 min 左右，致癇性海馬區(qū)出現(xiàn)谷氨酸濃度升高，但非癲癇側(cè)海馬區(qū)沒有出現(xiàn)谷氨酸濃度升高。癲癇發(fā)作時，谷氨酸水平進(jìn)一步升高，非癲癇側(cè)海馬區(qū)的谷氨酸濃度也開始增加。癲癇發(fā)作后10 min，非癲癇側(cè)海馬區(qū)谷氨酸濃度已恢復(fù)到基線水平，而癲癇側(cè)海馬區(qū)在癲癇發(fā)作后15 min后谷氨酸水平仍持續(xù)升高。患者接受癲癇側(cè)海馬的手術(shù)切除后，切除組織的顯微鏡觀察顯示，在海馬組織中出現(xiàn)中度至重度的錐體神經(jīng)元缺失，并伴有反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸處理可通過增強原代培養(yǎng)、器官型海馬切片和急性切片制劑中EAAT2 在嚙齒動物星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表面擴散，增加星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸清除。進(jìn)一步揭示了通過激活星形細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體可以增加星形細(xì)胞谷氨酸清除的功能［19－20］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制EAAT2 的擴散可以改變突觸動力學(xué)，增加自發(fā)興奮性突觸后電流的上升和衰減時間，總谷氨酸清除調(diào)控EAAT 表面表達(dá)的動態(tài)機制可能對星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能性谷氨酸清除速度和能力有重要影響［21］。研究發(fā)現(xiàn)對谷氨酸穩(wěn)態(tài)的破壞能夠干擾突觸傳遞，進(jìn)而干擾經(jīng)典和穩(wěn)態(tài)類型的突觸連接和突觸可塑性。考慮到可塑性在發(fā)育過程中形成回路的重要性，即使星形細(xì)胞介導(dǎo)的谷氨酸穩(wěn)態(tài)受到輕微破壞，也可能導(dǎo)致早期大腦失調(diào)的缺陷［22］。TODD 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，動物模型中去除功能性星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT－1/EAAT2，就足以導(dǎo)致致命的癲癇，這表明星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體功能障礙或低表達(dá)可能在某些癲癇障礙的發(fā)展中發(fā)揮作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞中EAAT2在谷氨酸穩(wěn)態(tài)中相關(guān)機制的示意圖見圖1。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞中EAAT2在谷氨酸穩(wěn)態(tài)中相關(guān)機制的示意圖

星形膠質(zhì)細(xì)胞吸收的谷氨酸經(jīng)谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外空間后被突出前神經(jīng)元吸收，再經(jīng)谷氨酰胺酶（glutaminase）轉(zhuǎn)化回谷氨酸，谷氨酸通過囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運體到達(dá)突出間隙，一部分谷氨酸與突觸后神經(jīng)元的谷氨酸受體相結(jié)合，一部分則通過谷氨酸轉(zhuǎn)運體（EAAT2/GLT－1）轉(zhuǎn)運至星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，以降低突出間隙的谷氨酸濃度，防治谷氨酸興奮性毒性，從而抑制癲癇發(fā)作。

3 EAAT2在癲癇發(fā)病中的相關(guān)研究

許多研究提供了充足的證據(jù)表明癲癇發(fā)作影響了EAATs 的表達(dá)水平，表明癲癇期間谷氨酸釋放和神經(jīng)元活動的增強可能導(dǎo)致了EAATs 表達(dá)的調(diào)節(jié)，癲癇期間EAATs 的調(diào)節(jié)過程尚不完全清楚，但似乎是一個動態(tài)過程，涉及多個因素，包括代償機制和離子梯度的變化［24］。SUGIMOTO 等［25］通過復(fù)制整體GLT－1 缺失小鼠的表型發(fā)現(xiàn)，背側(cè)前腦特異性GLT－1 敲除小鼠出現(xiàn)非致命的復(fù)雜癲癇發(fā)作，包括肌陣攣痙攣、多動性奔跑、痙攣和陣攣痙攣。這表明，背側(cè)前腦GLT－1 功能障礙參與了嬰幼兒癲癇的發(fā)病機制，間腦、腦干和脊髓的GLT－1 可能在癲癇發(fā)作性猝死的預(yù)防中非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)生的急性期（癲癇持續(xù)狀態(tài)后的前72 h）伴有海馬谷氨酸升高和GLT－1 mRNA 表達(dá)下調(diào)，用頭孢曲松治療可使癲癇動物急性期谷氨酸水平降低，谷氨酰胺合成酶活性和GLT－1 表達(dá)水平升高。表明星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取可通過上調(diào)GLT－1 表達(dá)水平，降低谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性，從而發(fā)揮治療癲癇的作用［26］。PETERSON 等［27］發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞類型特異性的GLT－1 上調(diào)在癲癇發(fā)生的早期時間點具有神經(jīng)保護(hù)作用，降低了癲癇發(fā)作的頻率和癲癇發(fā)作的總時間，并在癲癇模型中消除大的發(fā)作行為。HOTZ 等［28］發(fā)現(xiàn)，EAAT2 突變的斑馬魚幼蟲在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中表現(xiàn)出周期性的自發(fā)和光誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作，這與細(xì)胞外谷氨酸水平的突然增加相一致，揭示了EAAT2 在平衡大腦興奮性方面的本質(zhì)以及它與癲癇發(fā)作的直接聯(lián)系。有研究對匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇模型中差異表達(dá)基因的微陣列分析，確定了3 232 個與癲癇高度相關(guān)的潛在基因。編碼人類EAAT2 蛋白的SLC1A2 基因被發(fā)現(xiàn)與大腦發(fā)育相關(guān)，在癲癇患者海馬區(qū)其表達(dá)顯著降低，提示EAAT2 可能是癲癇的潛在生物標(biāo)志物［29］。以上研究表明，谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2 能夠清除細(xì)胞外間隙谷氨酸，抑制谷氨酸興奮性毒性從而介導(dǎo)癲癇的發(fā)生、發(fā)展，可以為癲癇的治療提供了新的切入點。

4 中醫(yī)藥對EAAT2的研究

4.1 中藥單體及復(fù)方

LIU 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，逍遙散可通過改善星形膠質(zhì)細(xì)胞和EAAT2 的功能，減輕谷氨酸誘導(dǎo)的額葉皮層神經(jīng)元損傷而發(fā)揮抗抑郁作用。靈芝多糖能明顯降低癲癇模型大鼠腦組織中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK14）的表達(dá)水平，增強其鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）和GSHPx 的活性，抑制癲癇的發(fā)作。其抗癲癇的機制可能與靈芝多糖升高谷氨酸轉(zhuǎn)運體［如GLAST（EAAT1）、GLT－1（EAAT2）、EAAC1（EAAT3）］的表達(dá)而降低神經(jīng)細(xì)胞興奮性、延長癲癇發(fā)作時間間隔有關(guān)［31］。楊蕙等［32］研究發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方可有效調(diào)控糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸水平，其可能通過激活腺苷A1 受體、上調(diào)EAAT2 表達(dá)，從而減輕糖尿病并發(fā)抑郁癥的興奮性神經(jīng)毒性，進(jìn)而產(chǎn)生抗抑郁作用。朱曉煜等［33］研究發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝湯可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，下調(diào)AEG－1 mRNA 的表達(dá)，上調(diào)EAAT2 mRNA 的表達(dá)，減少小鼠顳葉癲癇發(fā)作次數(shù)及縮短發(fā)作持續(xù)時間，改善海馬CA1、CA3區(qū)的神經(jīng)元損傷。人參皂苷Rb1 可能通過上調(diào)Glu－Gln 循環(huán)上的關(guān)鍵環(huán)節(jié)GLT－1 和GS 表達(dá)及活性來調(diào)節(jié)Glu 代謝，從而發(fā)揮抗癲癇和改善神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用。有研究通過采用人參皂苷Rb1 干預(yù)癲癇小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1 治療性給藥能緩解癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度，改善腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷，具有抗癲癇作用，其作用機制可能與上調(diào)Glu－Gln 循環(huán)上的關(guān)鍵環(huán)節(jié)GLT－1 和GS 表達(dá)和活性，從而調(diào)節(jié)Glu 代謝有關(guān)［34］。以上數(shù)據(jù)表明，中藥單體及復(fù)方可以通過上調(diào)EAAT2 起到保護(hù)神經(jīng)元、抗癲癇的作用。

4.2 針刺

針刺作為中醫(yī)學(xué)的經(jīng)典治療方法，在治療癲癇、阿爾茨海默病、兒童孤獨譜系障礙等神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病中具有潛在的臨床應(yīng)用價值。錢旭等［35］通過研究針刺對卒中后痙攣大鼠海馬區(qū)EAATs 影響發(fā)現(xiàn)，模型組缺血側(cè)海馬區(qū)GLT－1 含量及蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，兩針刺組缺血側(cè)海馬區(qū)GLT－1含量及蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）；與“陽陵泉”組比較，“陽陵泉”+“百會”組缺血側(cè)海馬區(qū)GLT－1含量及蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），因此針刺可以通過上調(diào)海馬EAATs的表達(dá)發(fā)揮抗卒中后痙攣的作用。紀(jì)倩等［36］研究發(fā)現(xiàn)，脈沖電針、音樂電針通過上調(diào)大鼠海馬內(nèi)EAAT1、EAAT2 mRNA 的表達(dá)，改善谷氨酸再循環(huán)，對神經(jīng)元起到保護(hù)作用。羅丁等［37］研究發(fā)現(xiàn)，電針上調(diào)前額皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞EAAT1、EAAT2表達(dá)，提高谷氨酸攝取功能，可能是針刺保護(hù)神經(jīng)元的機制之一。

5 總結(jié)與展望

癲癇根據(jù)其核心臨床癥狀可歸屬于“癇病”，其病機概括為陰陽失調(diào)，氣血逆亂。中醫(yī)藥內(nèi)治和外治不僅緩解癲癇發(fā)作癥狀，而且有一定延長癲癇發(fā)作間期的作用［38］。中藥多成分、多靶點的特點，使中醫(yī)藥在抗癲癇方面有副作用低、預(yù)防復(fù)發(fā)等優(yōu)勢，對于癲癇的治療具有極高的臨床價值。

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇發(fā)病中起關(guān)鍵作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸穩(wěn)態(tài)失衡會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外興奮性神經(jīng)遞質(zhì)變化，神經(jīng)元突觸間谷氨酸清除下降所致興奮性神經(jīng)毒性，進(jìn)而參與癲癇的發(fā)病過程。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞類型，具有支持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致基礎(chǔ)谷氨酸水平升高，而上調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2，在谷氨酸穩(wěn)態(tài)中扮演中心角色。目前尚不清楚，將谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2 作為一種新的抗癲癇（控制藥物耐藥性癲癇發(fā)作）或抗癲癇源性（改善疾病預(yù)防癲癇發(fā)作后的發(fā)展）策略是否更有效。對上調(diào)EAAT2 達(dá)到抗癲癇的治療策略處于初步探索階段，筆者認(rèn)為未來的研究方向應(yīng)注意以下幾點：①深入探究谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2 在星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元之間釋放谷氨酸和谷氨酸受體識別谷氨酸的主要機制；②應(yīng)從臨床和動物實驗兩個方面入手，探討星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT2 在癲癇發(fā)作時對神經(jīng)元的保護(hù)作用，例如在適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ椭猩险{(diào)GLT－1（EAAT2），與傳統(tǒng)的神經(jīng)元中谷氨酸傳遞的抑制相比，為癲癇的治療提供新的方向；③中醫(yī)學(xué)基于整體觀念，對疾病防治有整體系統(tǒng)性；中藥具有多成分多靶點的特點，未來應(yīng)從分子生物學(xué)入手，探究中醫(yī)中藥上調(diào)EAAT2 的具體成分，為中醫(yī)藥治療癲癇提供科學(xué)依據(jù)。