基于Caspase－1/GSDMD焦亡通路探討復方血栓通膠囊對視網膜血管炎的作用機制

吳越，張恬，李笑，張秀園，劉炬，2?

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250013；2.山東省千佛山醫院，山東 濟南 250014）

視網膜血管炎（retinal vasculitis，RV）是以視網膜血管的炎癥性改變為主的疾病，其主要表現為視網膜血管擴張，血管周圍有黃白色炎性滲出或白鞘，且伴有脈絡膜、玻璃體的眼后段炎癥反應［1］。目前視網膜血管炎的發生機制尚不明確，大多認為與自身免疫反應有關。細胞焦亡是一種炎癥性、程序性細胞死亡方式［2］。它主要通過炎癥小體介導多種半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）激活，導致多種Gasdermin 家族成員發生剪切和多聚化，引發細胞膜孔道形成，釋放細胞內容物和成熟的炎癥因子至胞外，并擴大炎癥級聯反應，例如白細胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）、白細胞介素－18（interleukin－18，IL－18）等［2］。Gasdermin D（GSDMD）是Gasdermin 家族中研究廣泛的成員之一，也是焦亡過程中的執行者［3］。研究表明，IL－1β 等細胞因子驅動炎癥改變，對視網膜微血管內皮細胞造成損傷，導致糖尿病視網膜病變［4］、白塞?。?］的標志性血管病變。已有研究表明［6］，焦亡在自身免疫性疾病中發揮作用。因此，焦亡可能是視網膜血管炎的發生機制之一。

近年來，臨床上治療視網膜血管炎常使用糖皮質激素、免疫抑制劑、激光手術等療法。然而，這些療法存在治療周期長、毒副作用大且價格昂貴等不足。中醫學從整體觀念出發，對視網膜血管炎進行辨證論治并取得良好的臨床療效。復方血栓通膠囊是由三七、丹參、黃芪和玄參四味中藥構成的中成藥制劑，在活血化瘀、保護視網膜血管結構［7］、改善微循環［8］、抗炎［9］等方面具有突出療效，且價格適中。在臨床上，常用來治療糖尿病視網膜病變［9］、黃斑水腫［10］、視網膜靜脈阻塞［11］、青光眼［12］等疾病。目前，復方血栓通膠囊對視網膜血管炎的治療作用及其機制尚未見有文獻報道，復方血栓通膠囊是否通過焦亡介導的炎癥反應改善視網膜血管炎尚需進一步的研究。

本實驗通過建立小鼠視網膜血管炎模型，觀察復方血栓通膠囊對視網膜血管炎的治療作用，并探討其治療視網膜血管炎的作用機制，為臨床治療提供更多生物靶點和用藥依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性8周齡C57BL/6小鼠60只，體質量20～25 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號：20210927Abzz0619000395。正常飼料喂養，12 h晝夜交替7 d后進入實驗。本動物實驗經山東省千佛山醫院倫理委員會批準進行（編號：QFSYY20210006）。

1.2 藥品與試劑

復方血栓通膠囊（廣東眾生藥業股份有限公司，批號：210215）；醋酸潑尼松片（天津天藥藥業股份有限公司，批號：2011143）；復方托吡卡胺滴眼液（沈陽興齊眼藥股份有限公司，批號：200801）；氧氟沙星眼膏（沈陽興齊眼藥股份有限公司，批號：210302）；人IRBP（1－20）肽（美國Med Chem Express 公司，批號：298202－25－2）；百日咳毒素（北京博蕾德科技發展有限公司，批號：181242A1）；完全弗氏佐劑（美國Sigma 公司，批號：9007812）；4%多聚甲醛通用型組織固定液（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：69111800）；蘇木素染色劑（北京索萊寶科技有限公司，批號：ZH190905）；伊紅染色劑（北京索萊寶科技有限公司，批號：XH184205）；RNA 組織/細胞快速提取試劑盒（TIAN GEN 公司，批號：W9928）；4 × g DNA wiper Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：7E581k1）；5×HiScript?ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：7E542I1）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：027E2222BA）；GSDMD（Affinity Boisciences 公 司，批號：AF4012）；Caspase－1（Proteintech 公司，批號：22915－1－AP）；Cleave－IL－1β（Affinity Biosciences 公 司，批號：38c0979）；吐溫－20（Solarbio 公司，批號：923V011）；Pierce?BCA 蛋白檢測試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，批號：UJ290653）；小鼠白介素（IL－1β）酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：E－MSEL－M0003）。

1.3 儀器

小動物視網膜成像系統（Optoprobe，型號：Opto－Ris Pro）；普通臺式離心機（Thermo Fisher Scientific，型號：micro17＆21）；光學顯微鏡（Primotech，型號：蔡司ZEISS）；顯微鏡（Olympus，型號：CX33）；超聲波破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：JY96－IIN）；生物病理切片機（濟南童鑫生物科技有限公司，型號：QPJ－1C）；制冰機（Ziegra，型號：ZBE 70－35）；Milli－Q?臺式純水系統（Merck，型號：ZIQ7003T0）；Western blot 凝膠電泳系統（Bio Rad，型號：164－5052）；超靈敏多功能成像儀（GE，型號：Amersham Imager 680）；PCR 擴增儀（Bio－Rad，型號：T100）；實時熒光定量PCR 儀（Bio－Rad，型號：CFX96）；移液器（Eppendorf，型號：3120 000.283）；漩渦振蕩器（其林貝爾，型號：VORTEX-5）；酶標儀（Thermo Fisher，型號：1510）。

2 方法

2.1 動物分組與造模

將8 周齡60 只雄性C57BL/6 小鼠在溫度25 ℃，濕度50%～70%實驗室規范下飼養，自由飲水進食。將小鼠隨機分為5 組：空白組（Control）、模型組（Model）、復方血栓通低劑量組（FXST－L）、復方血栓通中劑量組（FXST－M）和復方血栓通高劑量組（FXST－H）。待小鼠活動穩定后，對Model、FXST－L、FXST－M、FXST－H 組小鼠進行麻醉，將人IRBP1－20 肽溶液（100 μL，5 mg/mL）與完全弗氏佐劑（100 μL，含5 mg/mL結核分枝桿菌）1∶1 混勻并充分乳化，再將200 μL 的白色乳劑分別在Model、FXST－L、FXST－M、FXST－H組小鼠的頭頸部、左右大腿根部及尾根部皮下注射；給予Control 組小鼠等容積的生理鹽水進行皮下注射造模。在進行主動免疫造模后，再向Model、FXST－L、FXST－M、FXST－H 組小鼠皮下注射免疫佐劑百日咳毒素（100 μL，5 μg/mL）；給予Control 組小鼠等容積生理鹽水進行腹腔注射。

2.2 動物給藥及處理

造模24 h 后，各組小鼠灌胃給藥，頻率為每日1次，灌胃容積均為0.02 mL/g。其中，Control、Model組灌胃0.02 mL/g 蒸餾水；FXST－L、FXST－M、FXST－H組分別為灌胃0.6、1.2、2.4 g/kg 復方血栓通溶液。21 d 后，各組取2 只小鼠利用小動物視網膜成像系統觀察小鼠視網膜組織病理變化。其余小鼠腹腔注射40 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉處死并摘取小鼠眼球。各組小鼠的右眼球用PBS 沖洗，迅速置入眼球固定液中備用，左眼球置于顯微鏡下分離視網膜，液氮保存備用。

2.3 活體眼底照相

采用小動物視網膜成像系統，取各組2 只小鼠，腹腔下注射進行全身麻醉，麻醉后再固定小鼠。采用復方托吡卡胺滴眼液給小鼠眼球散瞳，氧氟沙星眼膏保護角膜免受強光損害。調整小動物視網膜成像系統進光角度，進行小鼠活體眼底照相。

2.4 HE染色法觀察小鼠視網膜組織的病理變化

首先，將眼球固定液固定后的小鼠右眼球進行石蠟包埋。沿角膜－視神經軸方向，用生物病理切片機將石蠟塊切成6 μm厚的切片移至載玻片上。然后，將石蠟切片常規脫蠟水化，進行蘇木素－伊紅（HE）染色后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片。最后，在顯微鏡下觀察小鼠眼底視網膜及玻璃體腔的組織結構病理改變、炎性細胞浸潤情況。

2.5 RT－PCR法檢測各組小鼠視網膜組織Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA表達水平

將小鼠視網膜組織分離后，使用Omega 總RNA 提取試劑盒提取小鼠視網膜組織RNA，用HiScript?ⅢRT SuperMix for qPCR（+ gDNA wiper）進行逆轉錄，之后用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 進行實時熒光定量PCR，使用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2.6 Western blot 法檢測各組小鼠視網膜組織中Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β蛋白表達情況

提取各組小鼠視網膜組織蛋白后，將制備的蛋白樣品通過BCA法進行蛋白濃度測定，依次進行蛋白變性、制備12.5%凝膠、蛋白上樣、恒壓電泳、恒流轉膜、脫脂牛奶封閉、一抗Caspase－1（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、Cleave－IL－1β（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）稀釋后孵育、二抗（1∶10 000）稀釋后孵育抗原抗體反應、顯影曝光、拍照等步驟。

2.7 ELISA 法檢測各組小鼠血清中IL－1β 的表達水平

提取各組小鼠眼眶血后，低溫3 000 rpm 離心15 min，分離血清。根據小鼠白介素（IL－1β）酶聯免疫吸附測定試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀于450 nm 處進行吸光度測定，繪制標準曲線，計算出血清IL－1β水平。

2.8 統計學方法

數據統計采用GraphPad Prism 8.0統計軟件處理，以±s表示，采用one－way ANOVA進行統計分析，P ＜0.05代表差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠視網膜組織的血管變化

給藥21 d后，利用小動物視網膜成像系統觀察小鼠眼底視網膜組織的血管變化。結果發現，Control組小鼠視網膜血管自視盤發出，呈放射狀分枝形態，血管徑直，血管周圍無炎癥浸潤。與Control組比較，Model組小鼠視盤邊緣模糊，可見彌漫性或局限性浸潤；視網膜血管可見靜脈增粗變形，血管中有白色袖帶廣泛浸潤；部分血管被遮擋，袖帶的尺寸大于血管直徑；此外，視網膜組織可見孤立性和線性病變。與Model組比較，FXST－L、FXST－M、FXST－H 組的病理情況均有改善。其中，FXST－H組的改善效果最為突出，其視網膜血管徑直且逐漸均勻變細，無迂曲擴張病變。見圖1。

圖1 視網膜成像系統觀察各組小鼠視網膜組織的血管變化

3.2 小鼠視網膜組織的病理變化

給藥21 d 后，利用HE 染色法觀察小鼠視網膜組織的病理變化。結果發現，Control 組視野中視網膜各層結構清晰，厚薄均勻，未見其他明顯異常。與Control組比較，Model 組視野中視網膜增厚，內外顆粒層厚薄不均，細胞排列不規則（黑色箭頭），內網狀層及內界膜以內可見較多粒細胞為主的炎性細胞浸潤（紅色箭頭）。與Model 組比較，FXST－L、FXST－M、FXST－H組的病理變化有明顯改善。其中FXST－L 組視野中視網膜增厚，內外顆粒層厚薄不均，細胞排列不規則（黑色箭頭），局灶性的結構紊亂（黃色箭頭），內網狀層及內界膜以內可見較多粒細胞為主的炎性細胞浸潤（紅色箭頭）。FXST－M 組視野中神經節細胞層可見少量血管擴張（黑色箭頭）。FXST－H 組視野中各層結構清晰，厚薄均勻，僅見炎性細胞浸潤，其余未見明顯異常。見圖2。

圖2 HE染色法觀察各組小鼠視網膜組織的病理變化（HE，×200）

3.3 各組小鼠視網膜組織中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA的表達水平

結果發現，與Control 組比較，Model 組小鼠視網膜組織中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA 的相對表達量顯著升高，差異具有統計學意義（P ＜0.01）。與Model比較，FXST－L、FXST－M、FXST－H組Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA 的相對表達量顯著下降。其中，FXST－H組中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA 的相對表達量下降較為明顯，差異具有統計學意義（P ＜0.01）。見圖3。

圖3 各組小鼠視網膜組織中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA的相對表達比較情況

3.4 各組小鼠視網膜組織中Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β的蛋白表達水平

與Control 組比較，Model 組小鼠視網膜組織中GSDMD－N、Caspase－1、IL－1β的蛋白相對表達水平顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與Model組比較，FXST－M 組小鼠視網膜組織中Caspase－1、GSDND－N、IL－1β 的蛋白相對表達水平降低。其中，FXST－H組小鼠視網膜組織中Caspase－1、GSDND－N、IL－1β的蛋白水平明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見圖4、圖5。

圖4 各組小鼠視網膜組織中Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β的蛋白表達情況

圖5 各組小鼠視網膜組織中Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β 蛋白相對表達比較情況

3.5 各組小鼠血清中IL－1β的表達水平

與Control 組比較，Model 組小鼠血清中IL－1β 的表達水平顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與Model 組比較，FXST－L、FXST－M 組小鼠血清中IL－1β 的表達水平降低。其中，FXST－H 組小鼠血清中IL－1β 的水平明顯下降，差異具有統計學意義（P ＜0.01）。見圖6。

圖6 各組小鼠血清中IL－1β的表達情況

4 討論

視網膜血管炎（RV）是以視網膜中血管炎癥為主要病變的疾患，常伴有脈絡膜、玻璃體的眼后段炎癥反應［1］。本病好發于20～40 歲青壯年［13］，既可以單獨發?。?4］，也可以是全身性疾病的眼部臨床表現［15-16］。視網膜血管炎病因和發病機制復雜，并且易反復發作，給患者及家庭帶來嚴重的身心負擔。臨床最常用的治療藥物是皮質類固醇聯合免疫抑制劑，但治療周期長，長期使用會引起全身嚴重并發癥，毒副作用大且易復發。由于本病難以治愈，病情往往隨時間延長而加重。因此，目前本病研究中急需解決的重要問題是尋求特異且有效的治療方法。

視網膜血管炎屬“絡損暴盲”范疇［17］，該病名首見于《臨床必讀》。以絡損暴盲而論，肝郁、痰凝所致之氣滯血瘀，或氣逆、氣虛所致之血不歸經，皆可產生血絡破損病理變化與瘀血病理產物?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗吩疲骸皥哉呦髦?，結者散之，留者攻之”，故見瘀血積滯，先逐其瘀血。復方血栓通膠囊是經現代萃取工藝制成的中成藥制劑。方中選用活血化瘀之三七為君藥，破瘀生新而輔君之丹參為臣藥，大補元氣之黃芪和滋陰明目之玄參為佐藥，合用則具化瘀生新、活血養目之效。研究表明，復方血栓通膠囊具有促纖溶、抗血栓，增加微循環灌注，改善血液流變學的黏、濃、聚狀態，調節脂質代謝［11，18-19］的藥理作用。通過網絡藥理學分析［8］，篩選出復方血栓通膠囊改善微循環的活性成分41 個，潛在作用靶點40 個，主要通過血管、免疫炎癥、神經活性、糖尿病相關通路發揮作用。隨著中醫藥研究的不斷深入，復方血栓通膠囊已經成為治療眼底血管性疾病的重要藥物之一。本實驗建立小鼠視網膜血管炎模型，觀察到復方血栓通膠囊可有效改善視網膜組織的病理變化，FXST－H 組可明顯緩解小鼠眼底中血管以及視網膜組織中的病理變化，血管周圍炎癥浸潤減輕，驗證了復方血栓通膠囊可有效改善視網膜組織的炎癥病理，但其機制尚不清楚。

當不同病原體感染宿主時，焦亡可作為宿主的一種防御機制，激活天然免疫系統來抵抗微生物的入侵。在焦亡過程中，炎癥小體激活Caspase－1/4/5/11 信號通路。激活的Caspase－1/4/5/11 將IL－1β、IL－18 剪切為成熟形式，并水解GSDMD 蛋白氨基端形成有活性的N端結構（N－terminal domain，GSDMD－N）［3］。GSDMD－N具有脂溶性，能特異性地結合細胞膜形成膜孔道［20］。細胞內容物和成熟的炎癥因子（IL－1β、IL－18）從膜孔中流出引發細胞焦亡。已有研究表明，焦亡在感染性疾?。?1］、自身免疫性疾?。?］、心血管性疾?。?2］以及腫瘤［23］等疾病中發揮作用。以上研究提示，小鼠視網膜血管炎可能與焦亡相關，而復方血栓通膠囊是否通過焦亡介導的炎癥反應改善視網膜血管炎尚需進一步的研究。

在本實驗中，筆者檢測了不同組別視網膜組織中GSDMD、Caspase－1、IL－1β mRNA 和Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β蛋白表達水平，血清中IL－1β的含量。結果顯示，與Control 組比較，Model 組視網膜組織中GSDMD、Caspase－1、IL－1β mRNA 和Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β蛋白表達水平、血清中IL－1β的含量均明顯升高，以上結果表明視網膜血管炎中存在焦亡的炎癥表達；與Model組比較，FXST－H 組視網膜組織中Caspase－1、GSDMD、IL－1β mRNA 和Caspase－1、GSDMD－N、IL－1β 蛋白表達水平、血清中IL-1β 的含量均顯著降低，以上結果表明復方血栓通膠囊能緩解視網膜血管炎中焦亡的炎癥表達。

綜上所述，復方血栓通膠囊可有效改善視網膜血管炎的病理變化，其機制可能是通過抑制Caspase－1/GSDMD 焦亡通路降低炎癥反應，最終達到治療作用。本研究闡述了復方血栓通膠囊對小鼠視網膜血管炎焦亡的作用及機制，為視網膜血管炎治療提供了有效靶點和用藥依據。