芪貞提取物對CTX誘導小鼠免疫低下的修復作用研究

盧迪，王曉宇，齊六衛，趙寶凱，王大成，閆琰?

（1.沈陽偉嘉生物技術有限公司，遼寧 沈陽 110027；2.北京大偉嘉生物技術有限公司，北京 100085；3.吉林大學動物科學學院，吉林 長春 130062）

免疫系統是機體抵抗外邪侵入的重要屏障，免疫系統的調控水平決定了機體的健康程度。如果免疫器官萎縮、免疫細胞分泌水平低下、免疫反應遲緩，則機體長期處于亞健康狀態，為外邪侵入提供了可乘之機。御其外必先安其內，從根本上提升機體的免疫水平，是防控疾病的關鍵，臨床實踐證實中藥調控免疫系統效果較好［1－3］。

芪貞提取物（QE）由黃芪、淫羊藿、女貞子組成，具有增強機體免疫力、改善免疫抑制狀況、促進抗體形成等功能。黃芪具有提高淋巴細胞轉化率、提高機體對抗原的免疫應答能力，并能增強巨噬細胞的吞噬能力，對不同原因引起的免疫功能降低具有明顯改善作用［4－5］；淫羊藿具有增強機體免疫功能，促進細胞的增殖和發育，增強機體特異性免疫和非特異性免疫［6－8］；女貞子多糖能夠調節機體免疫力，能夠促進淋巴細胞增殖［9－10］。本試驗采用環磷酰胺人工誘導小鼠免疫低下的方法，利用碳粒廓清試驗、半數溶血素試驗和遲發型超敏反應試驗，驗證芪貞提取物對小鼠的免疫修復作用，為臨床應用提供依據，現報道如下。

1 材料

1.1 藥品及試劑

芪貞提取物（沈陽偉嘉生物技術有限公司，批號：20011101）；印度墨汁（德制Chroma牌，80 mg碳粒/mL）；綿羊紅細胞（北京博爾西科科技股份有限公司，批號：201118）；環磷酰胺（天津市廣成化藥試劑有限公司，批號：202008126）；2，4－二硝基氟苯（廣東惠令化學試劑有限公司，批號：201021）；都氏試劑（石家莊華瑞創新生物技術開發中心，批號：202008）；無菌生理鹽水和1%碳酸鈉溶液（天津市廣成化藥試劑有限公司）；豚鼠血清（江蘇科晶生物科技有限公司）；IL－2、IL－4、IFN－γ 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20200221）。

1.2 儀器

電子分析天平（天津天馬橫基儀器有限公司）；微量移液器（德國Eppendorf 公司）；TG16A－WS 型臺式高速離心機（北京醫用離心機廠）；UV－9100紫外分光可見光度計（北京瑞利分析儀器廠）；真空采血管（河北超然醫療器械有限公司）；RT－600 全自動酶標儀（美國Rayto雷杜公司）。

1.3 動物

SPF 級ICR 小鼠150 只，體質量（20 ± 1）g，雌雄各半，許可證號：SCXK（遼）2020－0001，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供；標準飼料喂養，飼養環境為清潔級環境，溫度（23±1）℃，濕度（55±5）%。

2 方法

2.1 碳粒廓清試驗方法

參考文獻［11］的方法，將50只小鼠隨機分為5組，每組10 只，分別為空白對照組、模型對照組、QE 低劑量組、QE中劑量組和QE高劑量組。除空白對照組外，各組試驗小鼠在試驗開始后連續3 d 腹腔注射環磷酰胺，同時每天灌喂芪貞提取物（QE），連續給藥3 d，給藥劑量見表1。于最后一次給藥1 h 后，小鼠尾靜脈注射25%印度墨汁200 μL，在注射后分別于2 min（t1）、15 min（t2）用毛細管刺入內眥（眼眶）靜脈叢取血20 μL，并立即加入2 mL 0.1%碳酸鈉溶液中，等其充分搖勻后，于600 nm 波長處測定光密度值（OD）。小鼠頸椎脫臼處死，分別稱取肝臟和脾臟質量。

表1 碳粒廓清試驗給藥劑量

按公式（1）和（2）計算廓清指數K、校正廓清指數（吞噬指數）α：

2.2 半數溶血素試驗方法

參考文獻［12］的方法，將50只小鼠隨機分為5組，每組10 只，分別為空白對照組、模型對照組、QE 低劑量組、QE 中劑量組和QE 高劑量組，連續給藥7 d，給藥劑量見表2。除空白對照組外，其余組在給藥期間每日腹腔注射100 mg/kg 的環磷酰胺。所有組別在給藥第1 天開始對小鼠腹腔注射4%綿羊紅細胞（SRBC）混懸液0.2 mL 致敏，連續7 d。于小鼠最后一次致敏1 h后，摘除眼球取血，按常規方法制備血清。用生理鹽水將血清稀釋200 倍，取稀釋血清1 mL，4%綿羊紅細胞0.5 mL，10%豚鼠血清（補體）1 mL 于試管中混勻，空白對照用等體積生理鹽水代替小鼠血清，置于37 ℃孵育30 min。取出后冰浴終止反應，冷卻后6 000 r/min離心8 min。取上清液1 mL 加都氏試劑3 mL 于試管中混勻靜置10 min，于490 nm 波長處測定吸收值。另取0.25 mL 4%綿羊紅細胞和都氏液3.75 mL 混勻后測定綿羊紅細胞半數溶血時的吸收值。按公式（3）計算HC50的數值。

表2 半數溶血素試驗給藥劑量

2.3 遲發型超敏反應試驗方法

參考文獻［13－14］的方法，將50 只小鼠隨機分為5 組，每組10 只，分別為空白對照組、模型對照組、QE低劑量組、QE 中劑量組、QE 高劑量組，連續給藥7 d，給藥劑量見表2。各組小鼠從給藥第1 d 起（除空白對照組外）腹部去毛，于腹部暴露皮膚處均勻涂抹1%二甲硝基氟苯50 μL，每日1 次，連續7 d。全部小鼠于最后一次致敏1 h 后，將1%二硝基氟苯10 μL 均勻涂于小鼠右耳背側進行抗原攻擊，24 h后摘除眼球取血，脫頸處死，剪下左右兩耳，用6 mm 打孔器在兩耳相同部位打取耳片稱重，左右耳片重量之差為耳腫脹度。同時摘取小鼠胸腺、脾臟、精確稱重，計算胸腺指數和脾臟指數；按公式（4）計算耳腫脹率。Elisa法測定血清中IL－2、IL－4、IFN－γ的含量。

2.4 統計學方法

采用SPSS16.0 軟件進行統計學分析，結果以均數±標準差（±s）表示。使用方差分析兩組之間的差異，P＜0.05代表差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 碳粒廓清法試驗結果

與空白對照組相比，模型對照組廓清指數和吞噬指數（α）顯著降低（P＜0.01）。與模型對照組相比，QE 各給藥組的廓清指數和吞噬指數均升高，其中QE高、低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），QE 中劑量組差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠廓清指數和吞噬指數的比較（±s）

表3 各組小鼠廓清指數和吞噬指數的比較（±s）

注：與模型對照組相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01；與空白對照組相比，*P ＜0.01。

組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10廓清指數0.015 8±0.008 3 0.004 5±0.002 6*0.009 4±0.005 6a 0.014 3±0.003 3b 0.012 3±0.008 5a吞噬指數5.88±2.08 2.46±0.70*4.13±1.93a 5.70±1.04b 4.39±2.13a

3.2 半數溶血素試驗結果

與空白對照組相比，模型對照組血清溶血素HC50顯著降低（P＜0.01）。與模型對照組相比，QE 各給藥組的血清溶血素HC50均升高，其中QE 低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），QE 高、中劑量組差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠血清溶血素HC50的比較（±s）

表4 各組小鼠血清溶血素HC50的比較（±s）

注：與模型對照組相比，bP ＜0.01；與空白對照組相比，*P ＜0.01。

組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10血清溶血素HC50（%）154.71±34.57 80.33±20.77*119.71±48.91a 149.20±25.20b 139.03±26.07b

3.3 遲發型超敏反應試驗結果

3.3.1 各組小鼠臟器指數和耳腫脹率的比較

模型對照組脾臟指數和胸腺指數低于空白對照組，耳腫脹率高于空白對照組，差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）。與模型對照組相比，QE 各給藥組的小鼠脾臟指數均升高，其中QE 高、中劑量組差異有極顯著統計學意義（P＜0.01），低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）；QE 各給藥組的小鼠胸腺指數均升高，其中QE 高、低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），QE 中劑量組差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）；與模型對照組相比，QE 各給藥組的小鼠耳腫脹率均下降，差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）。見表5。

表5 各組小鼠臟器指數和耳腫脹率的比較（±s）

表5 各組小鼠臟器指數和耳腫脹率的比較（±s）

注：與模型對照組相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01；與空白對照組相比，*P ＜0.01。

組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10脾臟指數（mg/g）5.11±2.69 1.59±0.55*3.16±1.88a 4.98±0.83b 4.56±1.77b胸腺指數（mg/g）1.70±0.59 0.44±0.32*1.15±0.82a 1.62±0.76b 1.50±1.15a耳腫脹率（%）5.11±2.34 69.14±22.73*16.04±17.33b 6.55±1.49b 7.14±2.64b

3.3.2 各組小鼠細胞因子的比較

與空白對照組相比，模型對照組的小鼠細胞因子均降低（P＜0.01）。與模型對照組相比，QE 各給藥組IL-2 均升高，其中QE 高、低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），QE 中劑量組差異有極顯著統計學意義（P＜0.01）；與模型對照組相比，QE 各給藥組的小鼠細胞因子IL-4 和IFN-γ 均升高，其中QE 高、中劑量組差異有極顯著統計學意義（P＜0.01），QE 低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠細胞因子變化的比較（±s）

表6 各組小鼠細胞因子變化的比較（±s）

注：與模型對照組相比，aP ＜0.05，bP ＜0.01；與空白對照組相比，*P ＜0.01。

組別空白對照組模型對照組QE低劑量組QE中劑量組QE高劑量組n 10 10 10 10 10 IL－2（pg/mL）84.89±25.31 43.40±14.13*65.20±25.93a 76.03±19.05b 71.25±32.04a IL－4（pg/mL）31.06±14.11 5.75±3.04*15.08±11.21a 29.61±6.76b 24.77±10.83b IFN－γ（pg/mL）69.86±24.99 38.60±8.91*53.40±18.05a 67.10±9.22b 64.84±13.30b

4 討論

很多免疫調節藥物具有雙向調節作用，在機體免疫功能異常的情況下才能發現對免疫的影響，而在機體健康狀態下，這種免疫作用往往無法體現，所以成功建立免疫抑制的動物模型是試驗的關鍵［15－17］。環磷酰胺是臨床常用一種免疫抑制劑，對體液免疫和細胞免疫均有抑制作用［18－20］，以環磷酰胺作為化學刺激藥物誘導免疫抑制模型被廣泛應用于臨床藥物的評價［21－22］。參考馬玲等對于不同化學誘導劑誘發免疫失衡小鼠的研究，試驗中以環磷酰胺作為化學誘導劑，采用高劑量（100 mg/kg 體重）兩次腹腔注射，成功建立免疫低下小鼠模型，模型組在免疫器官指數、遲發性變態反應、血清中細胞因子含量方面與對照組均存在明顯差異［23］，為本次試驗提供參考。

脾臟和胸腺是機體重要的免疫器官，在免疫應答反應中起著重要的作用，也是衡量機體免疫功能的重要指標。小鼠血清溶血素水平和耳腫脹率是特異性免疫力的重要指標。免疫細胞因子IL－2、IL－4 能夠促進T 細胞的增殖，參與免疫調節，同時對B 細胞抗原提呈能力也起到促進作用，促使免疫系統對外源刺激快速產生應答反應；IFN－γ 也叫巨噬細胞活化因子，是Th1 細胞的標志性的細胞因子，可提高NK 細胞、吞噬細胞活性，是免疫功能評價的重要指標［24－25］。本次試驗中，芪貞提取物給藥組能夠提升細胞因子指數，具有顯著作用。

本研究以ICR 小鼠（SPF 級）為試驗動物，利用碳粒廓清試驗、半數溶血素試驗和遲發型超敏反應試驗，驗證QE 對小鼠的免疫修復作用。本研究表明，芪貞提取物（QE）能提高小鼠廓清指數、吞噬指數、血清溶血素HC50，提高小鼠脾臟和胸腺指數，降低耳腫脹率，提高小鼠血清中細胞因子指數（IL－2、IL－4、IFNγ），具有免疫修復作用，其中QE 中劑量組（200 mg/kg）效果最佳。