基于PI3K/Akt/FoxO3a信號通路探討壯骨止痛膠囊防治肌少－骨質疏松癥的作用機制

桑繼亮，楊巖冰，馬江濤，3，柴爽，3，葉茂林

（1.河南省開封市第二中醫院，河南 開封 475000；2.河南省洛陽正骨醫院（河南省骨科醫院），河南 鄭州 450046；3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405）

肌少－骨質疏松癥（osteosarcopenia，OS）［1］是一種肌少癥（sarcopenia，SP）與骨質疏松癥（osteoporosis，OP）并存的老年綜合征，患者表現為肌量、肌力和肌肉功能下降，同時骨量和骨密度下降。SP 引起的跌倒與OP 引起的脆性骨折相互疊加，易導致患者骨折、殘疾和虛弱狀態的發生，其發病率和病死率遠高于SP 或OP［2-3］。然而目前有關本病的基礎研究較少，尚無統一的用于基礎研究的動物模型構建方法，臨床實踐中也沒有同時靶向SP 和OP 的有效治療藥物［4］。網絡藥理學系統可整合疾病數據庫、藥物數據庫等現有資源，預測藥物作用的潛在靶點及通路，為成分復雜、作用廣泛的中藥復方研究及常見病、罕見病機制研究提供理論預測［5-6］。

OS 屬“痿證”范疇，病位在脾、腎。腎主骨，脾主肉，脾腎失調則“骨肉不相親”“骨枯肉痿”，故發為本病，治法以補腎健脾為主［7-8］。壯骨止痛膠囊由補骨脂、淫羊藿、枸杞子、女貞子、骨碎補、狗脊和牛膝組成，具有滋補肝腎、壯骨止痛的功效。壯骨止痛膠囊可明顯改善去勢大鼠骨形成標志物［9-10］，但其對SP、OS 作用的相關研究尚未見報道。本研究首先基于網絡藥理學方法預測壯骨止痛膠囊防治OS 的作用機制，然后通過構建OS 動物模型，驗證壯骨止痛膠囊防治OS 的效果及作用機制，為研究OS 的發病機制、動物OS 模型構建和藥物治療提供新的思路與方法。

1 材料

1.1 數據庫與分析平臺

采用TCMSP數據庫（https：//tcmsp－e.com/）、BATMAN－TCM 數據庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman－tcm/） 、GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數據庫（https：//www.omim.org/）、UniProt知識庫（https：//www.uniprot.org/）、Bioconductor數據庫（https：//www.bioconductor.org/，版本3.14）、STRING（https：//string－db.org/，版本11.5）、Perl 軟件（Perl 5，版本30）、R軟件（版本3.6.3）和Cytoscape軟件（版本3.7.2）進行預測及分析。

1.2 實驗動物

健康雌性SPF 級6月齡Sparague Dawley（SD）大鼠60 只，廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號：SCXK（粵）2018－0034。實驗在廣州中醫藥大學動物實驗中心SPF 級實驗室進行，溫度（23 ± 3）℃，濕度（50 ± 10）%，每天光照12 h。實驗經過廣州中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.3 主要藥品與試劑

地塞米松磷酸鈉注射液（三才石岐制藥股份有限公司，批號：20190350）；注射用青霉素鈉（山東魯抗醫藥股份有限公司，批號：190405）；戊酸雌二醇片（拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號：523A）；壯骨止痛膠囊（四川美大康藥業股份有限公司，批號：190601）。

Western 及IP 細胞裂解液、SDS－PAGE 凝膠配制試劑盒、電泳液及轉膜液等（Beyotime）；抗PI3K 抗體（批號：4257，CST）；抗磷酸化Akt 抗體（批號：4060，CST）；抗Akt 抗體（批號：4691，CST）；抗磷酸化FoxO3a抗體（批號：9666，CST）；抗GAPDH 抗體（批號：5174，CST）；HRP標記的羊抗兔IgG抗體（批號：0074430102，武漢愛博泰克）。

1.4 主要儀器

電子秤；大鼠抓力儀（YLS－13A型，濟南益延科技發展有限公司）；雙能X 線骨密度儀（Discovery A 型，美國Hologic 公司）；micro CT 儀（比利時Scanco Medical）；電泳儀/轉膜儀（美國Bio－Rad 公司）；凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 壯骨止痛膠囊防治OS的網絡藥理學研究

2.1.1 壯骨止痛膠囊有效成分的篩選及靶點預測

首先檢索TCMSP 數據庫和BATMAN－TCM 數據庫中補骨脂、淫羊藿、枸杞子、女貞子、骨碎補、狗脊和牛膝的活性成分，根據口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥ 30%和藥物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18［11］篩選活性成分及其對應靶點。然后采用Perl 軟件和UniProt 知識庫為篩選出的靶點添加基因名。

2.1.2 OS的靶點篩選

以“osteoporosis”“sarcopenia”“osteosarcopenia”為關鍵詞，采用GeneCards數據庫和OMIM 數據庫檢索并篩選OP、SP 和OS 疾病相關靶點，將所得OP 靶點與SP 靶點取交集，并與檢索到的OS 靶點取并集得到OS相關的所有靶點。

2.1.3 壯骨止痛膠囊活性成分－交集靶點調控網絡構建

將壯骨止痛膠囊活性成分靶點與OS 靶點進行一一映射，得到中藥－疾病的交集靶點，然后利用網絡圖像化軟件Cytoscape，構建活性成分－交集靶點調控網絡。其中節點表示活性成分或靶點，邊表示活性成分與靶點之間的關系。

2.1.4 PPI網絡的構建及核心靶點篩選

將中藥－疾病的交集靶點導入STRING 在線網站，設置研究物種為人，最小互作分數值為最高置信度0.9，其余參數保持默認設置，輸出結果。借助Cytoscape 的插件CytoNCA 對PPI 網絡進行拓撲學分析，根據度自由性（Degree，DC）＞61 和介度中心性（Betweenness，BC）＞600篩選關鍵靶點［12］。

2.1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將交集靶點導入R 軟件，限定物種為“智人”，P＜0.05 為閾值，采用Bioconductor 生物信息軟件包進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

2.1.6 KEGG調控網絡構建

利用Perl 軟件將交集靶點和富集最明顯的前20 個KEGG 通路進行一一映射，并采用網絡圖像化軟件Cytoscape構建交集靶點－KEGG通路。其中節點表示交集靶點或KEGG 通路，邊表示交集靶點與KEGG通路之間的關系。

2.2 壯骨止痛膠囊防治OS的動物實驗研究

2.2.1 分組、造模及給藥

將60 只SPF 級SD 大鼠按體質量依據隨機數字表隨機分為5 組，即正常組（Control 組）、假手術組（Sham組）、OS 組、OS 壯骨止痛膠囊組（OS + ZGZT 組）和OS雌二醇組（OS + E2組）。其中OS 組、OS + ZGZT 組和OS+E2組大鼠采用去勢法造模，Sham組采用假手術造模。除Control 組外，其余各組大鼠術后均每日肌內注射青霉素鈉8萬單位/只，連續3 d。術后恢復1周，1周后開始對OS組、OS+ZGZT 組和OS+E2組大鼠行地塞米松磷酸鈉注射液（DXM）1 mg/（kg·d）腹腔注射，連續2 周。造模結束后，開始藥物干預，按照大鼠用藥量=人每天用藥量/60×6.25，將壯骨止痛膠囊（5.4 g）和戊酸雌二醇片（1 mg）分別于研缽內研磨，生理鹽水溶解。Control組、Sham組和OS組大鼠每天灌胃10 mL/kg生理鹽水，OS+ZGZT 組每天灌胃0.562 5 g/kg 壯骨止痛膠囊溶液，OS + E2組每天灌胃0.104 mg/kg 戊酸雌二醇片溶液，連續用藥3個月。

2.2.2 大鼠一般情況觀察

每天觀察并記錄各組大鼠的攝食活動、精神狀態及異常行為等。干預結束后，電子秤測量各組大鼠體質量。

2.2.3 大鼠前肢抓力檢測

干預結束后，測量各組大鼠前肢抓力（forelimb grip strength）。測量時，將大鼠輕放在抓力儀上，抓住大鼠尾巴水平緩慢向后拉，確定大鼠前肢抓牢橫桿后肢離開橫桿時，平穩向后拉，直到大鼠前肢無法抓住橫桿，記錄儀器上的瞬時最大抓力值，測量3 次取平均值，作為反映前肢肌肉力量的指標。

2.2.4 大鼠骨密度、骨骼肌量檢測

取材前，麻醉大鼠，用雙能X線骨密度儀測量大鼠全身骨密度（bone mineral density，BMD）、腰椎BMD、全身骨骼肌量（lean mass，LM）和四肢骨骼肌量（appendicular lean mass，ALM），并計算大鼠骨骼肌質量指數（SMI，LM/BW）和四肢骨骼肌質量指數（RSMI，ALM/BW）。

2.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測PI3K、p－Akt、Akt和p－FoxO3a蛋白表達水平

取凍存的腓腸肌，液氮下研磨粉碎，裂解液裂解，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，蛋白樣品變性。配制凝膠，電泳，轉膜，封閉。依次加入PI3K（1∶1 000）、p－Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p－FoxO3a（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次15 min。HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次15 min。利用全能型凝膠成像系統顯影，并采用Image J 1.52a 軟件定量分析蛋白條帶。

2.3 統計學分析

數據分析采用SPSS 20.0 軟件，計量資料采用均數± 標準差（±s）表示。所有數據先進行正態性與方差齊性檢驗。若方差齊，組間兩兩比較采用LSD法，多組間比較采用單因素方差分析。若方差不齊，采用Dunnett's T3（3）法。P＜0.05 代表差異有統計學意義。

3 結果

3.1 網絡藥理學

3.1.1 有效成分的篩選及靶點預測結果

篩選得到活性成分89 個，靶點1 580 個。其中補骨脂活性成分3 個，對應靶點52 個；牛膝活性成分4 個，對應靶點188 個；狗脊活性成分2 個，對應靶點3 個；枸杞子活性成分35 個，對應靶點322 個；骨碎補活性成分15 個，對應靶點263 個；女貞子活性成分9 個，對應靶點307 個；淫羊藿活性成分21 個，對應靶點445個。

3.1.2 OS的靶點篩選結果

以“osteoporosis”“sarcopenia”“osteosarcopenia”為關鍵詞，采用GeneCards數據庫和OMIM 數據庫檢索并篩選與OP、SP 和OS 疾病相關的靶點，得到4 091個OP相關靶點，200個SP相關靶點和1個OS相關靶點。將4 091 個OP 相關靶點與200 個SP 相關靶點取交集，得到124 個交集靶點，見圖1。并與檢索到的1 個OS 靶點取并集后得到OS相關靶點125個。

圖1 OP與SP交集靶點的韋恩圖

3.1.3 調控網絡構建結果

將OS 疾病靶點與壯骨止痛膠囊中活性成分對應的靶點取交集后得到18個交集靶點，對應24個活性成分。其中，補骨脂2 個，牛膝1 個，枸杞子1 個，骨碎補5個，女貞子2個，淫羊藿10個，多味藥3個。見圖2。

圖2 壯骨止痛膠囊－肌少－骨質疏松癥－靶點調控網絡

3.1.4 靶點蛋白互作網絡（PPI）構建及核心靶點篩選結果

采用PPI 網絡使交集靶點可視化。為了進一步篩選關鍵靶點，利用Cytoscape 軟件的CytoNCA 插件進行網絡拓撲分析。當DC ＞61，BC ＞600 時，得到56 個節點和734 條邊?？梢妷压侵雇茨z囊可能影響與OP 相關的56個基因，而這56個基因之間直接或間接的作用高達734種。見圖3、圖4。

圖3 蛋白相互作用網絡（PPI）

圖4 中藥－疾病關鍵靶點篩選策略

3.1.5 GO和KEGG富集分析結果

GO 功能富集分析主要包括3 個部分，即生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）。壯骨止痛膠囊防治OS的作用主要與類固醇結合、類固醇激素受體活性、生長因子活性、整合素結合、胰島素樣生長因子（IGF）受體結合和胰島素受體（ER）結合等相關。富集比較明顯的KEGG 通路包括內分泌抵抗、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、FoxO 信號通路、PI3K/Akt 信號通路、催乳素信號通路、生長激素合成分泌和作用信號通路、雌激素信號通路以及表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等。見圖5、圖6。

圖5 壯骨止痛膠囊防治肌少－骨質疏松癥的GO功能富集分析

圖6 壯骨止痛膠囊防治肌少－骨質疏松癥的KEGG通路富集分析

3.1.6 KEGG關系網絡構建結果

KEGG關系網絡構建結果中紅色橢圓代表基因，綠色菱形代表KEGG通路；鄰接節點數目越多，圖形越大，作用越大，見圖7。

圖7 壯骨止痛膠囊防治肌少－骨質疏松癥的基因－通路調控網絡

16 個交集基因可通過調節20 個通路來影響OS 的發生，見表1。其中，胰島素樣生長因子－1（IGF－1）、細胞間黏附分子－1（ICAM1）、FOS、雌激素受體1（ESR1）、雌激素受體2（ESR2）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素－6（IL－6）和胰島素樣生長因子結合蛋白3（IGFBP3）等基因作用較大。

表1 KEGG通路富集結果

3.2 壯骨止痛膠囊防治OS的動物實驗研究結果

3.2.1 各組大鼠一般情況觀察

實驗過程中，Sham 組大鼠因術后傷口裂開感染死亡1 只，OS + ZGZT 組大鼠因灌胃誤吸死亡2 只，最終納入研究的動物數量為57只。

3.2.2 各組大鼠體質量及骨密度比較

干預結束后，各組大鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05）；與Control 組和Sham 組相比，OS 組大鼠全身BMD 和腰椎BMD 明顯下降（P＜0.05）；與OS 組相比，OS+ZGZT 組大鼠全身BMD 和腰椎BMD 明顯增加（P＜0.05）。表明壯骨止痛膠囊可明顯改善OS大鼠骨密度，防治OP。見圖8。

圖8 各組大鼠體質量及骨密度比較

3.2.3 各組大鼠前肢抓力、SMI和RSMI比較

與Control組和Sham組比較，OS組大鼠前肢抓力有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），SMI和RSMI則明顯下降（P＜0.05）；與OS組比較，OS+ZGZT組大鼠前肢抓力、SMI和RSMI明顯增加。表明壯骨止痛膠囊可明顯改善OS大鼠前肢抓力和骨骼肌量，防治SP。見圖9。

圖9 各組大鼠前肢抓力、SMI和RSMI比較

3.2.4 各組大鼠腓腸肌PI3K/Akt/FoxO3a 信號通路相關蛋白表達比較

與Control組和Sham組比較，OS組大鼠腓腸肌PI3K和p－FoxO3a 蛋白表達明顯增加；與OS 組相比，OS +ZGZT組大鼠腓腸肌PI3K、p－Akt和p－FoxO3a蛋白表達顯著增加。表明壯骨止痛膠囊可能通過上調PI3K/Akt/FoxO3a信號通路相關蛋白表達來防治OS。見圖10。

圖10 各組大鼠腓腸肌PI3K/Akt/FoxO3a信號通路相關蛋白表達比較

4 討論

目前臨床對于OS的發病機制、診斷標準及治療方法尚未達成共識，OS 的基礎研究還處于萌芽階段［4］，然而OS 引起的跌倒、脆性骨折、虛弱等不良健康結局較單一的OP 或SP 更為嚴重［2-3］。因此迫切需要結合現有的OS 臨床研究及基礎研究，建立OS 的診斷標準及動物模型，為OS的基礎研究和臨床研究提供研究載體及理論依據。壯骨止痛膠囊防治OP 效果顯著［9-10］，但能否防治OS 尚屬未知。本研究基于網絡藥理學方法預測壯骨止痛膠囊防治OS的作用機制，進而通過構建OS動物模型驗證壯骨止痛膠囊防治OS的效果和作用機制，為OS 的診斷標準、模型構建和藥物治療提供參考依據。

OS 的診斷包括OP 和SP兩個方面。OP 的診斷以WHO 推薦的DXA 測量的骨密度T 值為依據，即“-2.5 ＜T 值＜-1”診斷為骨量減少，“T 值≤-2.5”診斷為骨質疏松癥，“T值≤-2.5且伴一處或多處脆性骨折”診斷為嚴重骨質疏松癥［13］。而SP 的診斷則尚有爭議［14］，歐洲肌少癥工作組（EWGSOP）、國際肌少癥工作組（IWGS）、美國國立衛生院基金會（FNIH）和亞洲肌少癥工作組（AWGS）分別制定了各自的診斷標準。雖然診斷標準眾多，但基本均包括對肌力、肌量和肌肉功能的評估。肌力測量以優勢手握力為主，肌量測量以骨骼肌質量指數（全身骨骼肌質量/身高2）和四肢骨骼肌質量指數（四肢骨骼肌質量/身高2）為主，肌肉功能測量以步速為主。

目前鮮有OS動物模型構建的報道，已報道的研究或利用老齡去勢大鼠［15］或利用轉基因衰老型小鼠［16］來模擬OS表型。這些研究雖然為OS動物模型的構建提供了參考，但也存在造模周期長、造模成本高、模型不穩定、可重復性差、可比性差等嚴重問題，難以大面積推廣應用。結合課題組前期研究［11，17-18］，本研究動物實驗部分利用6月齡SD 雌性大鼠去勢結合DXM 腹腔注射造模的方法，然后分別灌胃壯骨止痛膠囊和雌激素3 個月，最后以大鼠全身BMD 和腰椎BMD、前肢抓力、大鼠SMI 和RSMI 為OS 評價標準，并對網絡藥理學預測出的PI3K/Akt/FoxO3a信號通路進行驗證。結果，本研究不僅成功構建OS大鼠模型，而且證明壯骨止痛膠囊可能通過上調PI3K/Akt/FoxO3a 信號通路相關蛋白表達來防治OS。

網絡藥理學研究表明，壯骨止痛膠囊防治OS的關鍵通路有內分泌抵抗、TNF 信號通路、FoxO 信號通路和PI3K/Akt 信號通路等，筆者對網絡藥理學預測出的FoxO 信號通路和PI3K/Akt 信號通路在動物實驗部分進行分子驗證。動物實驗研究結果顯示，與Control 組和Sham 組相比，OS 組大鼠全身BMD、腰椎BMD、SMI和RSMI 明顯降低，表明去勢聯合DXM 可導致大鼠發生OS。與OS 組相比，OS+ZGZT 組大鼠全身BMD、腰椎BMD、前肢抓力、SMI和RSMI明顯增加，表明壯骨止痛膠囊可明顯改善OS 大鼠BMD、肌力和肌量，防治OS。此外，壯骨止痛膠囊明顯提高了OS 大鼠腓腸肌中PI3K、p－Akt 和p－FoxO3a 蛋白表達水平，表明壯骨止痛膠囊防治OS 的作用可能與上調PI3K/Akt/FoxO3a信號通路相關蛋白表達有關。

本研究基于網絡藥理學方法預測壯骨止痛膠囊防治OS的作用機制，發現壯骨止痛膠囊防治OS的關鍵通路主要有內分泌抵抗、TNF信號通路、FoxO信號通路和PI3K/Akt信號通路等。進而通過構建OS大鼠模型驗證壯骨止痛膠囊防治OS的效果及作用機制，發現去勢聯合DXM可以構建OS動物模型，壯骨止痛膠囊可通過上調PI3K/Akt/FoxO3a 信號通路來改善大鼠全身及腰椎BMD、前肢抓力、SMI 和RSMI 等，為OS 的動物模型構建、評價標準確定和藥物選擇提供新的思路和方法。