基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析VEGFA在結(jié)腸癌中的表達(dá)及薏苡仁的干預(yù)研究

李周瑜，楊欣，張迎，石昌菊，金繼華

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

結(jié)腸癌是世界上第二大癌癥，病死率高，存活率低，嚴(yán)重威脅人類健康，主要由大腸內(nèi)層惡性贅生物引起［1］。目前，結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年上升狀態(tài)，臨床上主要采用傳統(tǒng)的化療、放療和外科手術(shù)結(jié)合中藥輔助治療，但在化療過程中使用的抗腫瘤藥物不僅抑制、殺滅腫瘤細(xì)胞，對正常細(xì)胞也具有破壞作用［2］。由于現(xiàn)階段缺乏有效的早期診斷手段，多數(shù)病人發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)為結(jié)腸癌晚期并發(fā)生轉(zhuǎn)移，幾乎無法手術(shù)根治，使結(jié)腸癌患者的預(yù)后變差。結(jié)腸癌的發(fā)展涉及多階段、多因素，受原癌基因或腫瘤抑制基因的共同影響［3］。

隨著多學(xué)科的相互交叉，腫瘤基礎(chǔ)檢測水平不斷提高，內(nèi)源性小分子中基因與蛋白表達(dá)的變化規(guī)律可以通過代謝組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測，以幫助人們對癌癥有更好的認(rèn)知，從而提高對于癌癥的預(yù)防、診斷和治療能力［4］。TCGA 是目前最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫，相比GEO 數(shù)據(jù)庫其優(yōu)勢是具有規(guī)范的臨床數(shù)據(jù)，不只展現(xiàn)在多種癌型上，還包括基因表達(dá)數(shù)據(jù)、miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)、DNA 甲基化和SNP 等［5］。本研究首先采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出結(jié)腸癌的關(guān)鍵靶點，基于TCGA 數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵靶點TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9、TNF 和EGFR 基因在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)狀態(tài)；采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫對TP53、MYC、VEGFA、EGFR、MMP9、JUN 基因進(jìn)行Kaplan－Meier 生存分析和Log－rankP檢驗；選擇與結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的基因VEGFA 和EGFR 探討其與臨床分期和多種臨床病理特征的關(guān)系；采用COX 比例風(fēng)險回歸模型對與臨床病理相關(guān)的基因VEGFA 進(jìn)行單因素和多因素分析。揭示VEGFA 基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義，為進(jìn)一步探討VEGFA 在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中的作用提供理論依據(jù)。

1 資料及方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）；STRING（https：//stringhttpsdb.org/）；Commparative Toxicogenomics Database（http：//ctdbase.org/）；Cytoscape 3.5.1軟件（http：//www.cytoscape.org）；GEPIA（http：//gepia.cancerhttpspku.cn/）。

1.2 結(jié)腸癌靶點篩選

通過CTD（Commparative Toxicogenomics Database）篩選結(jié)腸癌的潛在靶標(biāo)基因，通過疾病名稱（Colonic Neoplasms）或疾病ID（D003110）進(jìn)行在線篩選，選擇marker/mechanism（M）或者therapeutic（T）的靶標(biāo)為研究對象。

1.3 GO（Gene Ontology）功能分析

結(jié)腸癌靶點GO 功能分析基于DAVID 6.8（DAVID 6.8，https：//david.ncifcrf.gov/）在線分析，將174個靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，限定物種為人源，設(shè)定閾值P＜0.01，GO（Gene Ontology）注釋分析包含生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF）。

1.4 結(jié)腸癌Hub靶點篩選

基于Cytoscape 3.5.1 軟件中的CytoHubba 模塊篩選結(jié)腸癌的Hub靶點。包括連接度（degree）、邊緣滲出組件（edge percolated component，EPC）、最大鄰居組件（maximum neighborhood component，MNC）、最大鄰居組件的密度（density of maximum neighborhood component，DMNC）、最大團(tuán)中心性（maximal clique centrality，MCC）、瓶頸值（bottleneck，BN）、偏心度（EcCentricity）、緊密度（closeness）、發(fā)散性（radiality）、中介性（betweenness）、應(yīng)力（stress），本研究基于Degree、MNC、MCC和Stress四種算法輸出Hub基因［6-7］。

1.5 收集TCGA數(shù)據(jù)庫中表達(dá)數(shù)據(jù)

TCGA 數(shù)據(jù)庫（Access TCGA Data）下載結(jié)腸癌患者基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)（mRNA），基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)已進(jìn)行l(wèi)g2（x+1）轉(zhuǎn)化。基于perl 合并數(shù)據(jù)，刪除數(shù)據(jù)缺失及差異較大的樣本，確定473 例結(jié)腸癌樣品和41 例正常樣品，分析TP53、MYC、VEGFA、EGFR、MMP9、JUN 和TNF 基因在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)狀態(tài)，所有數(shù)據(jù)均使用R軟件處理（V3.5.1）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 3.5.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以mRNA 表達(dá)量的中位數(shù)為節(jié)點，將基因表達(dá)定義為高表達(dá)組和低表達(dá)組，用點圖對TCGA－結(jié)腸癌（COAD）數(shù)據(jù)集患者的TP53、MYC、VEGFA、EGFR、MMP9、JUN 和TNF表達(dá)進(jìn)行評價。采用GEPIA（http：//gepia.cancer－pku.cn/）數(shù)據(jù)庫用Kaplan－Meier 分 析TP53、MYC、VEGFA、EGFR、MMP9 和JUN 基因表達(dá)量與COAD 預(yù)后的相關(guān)性［8］。根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)庫的臨床數(shù)據(jù)，分析VEGFA 和EGFR 基因在不同等級COAD 組織中的mRNA 表達(dá)水平，探討其與COAD 臨床分期和多種臨床病理特征的關(guān)系。單因素分析和多因素分析采用Cox比例風(fēng)險回歸模型，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 薏苡仁的干預(yù)研究

薏苡仁化合物基于TCMSP 下載化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用SYBYL 對小分子進(jìn)行Minimize 能量最小化優(yōu)化，獲得合理構(gòu)象。采用藥物分子設(shè)計模擬SYBYL 2.1.1軟件的Surflex－Dock 模塊完成分子對接研究。從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB（http：//www.rcsb.org/pdb）獲取VEGFA蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：5T89）。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌靶點GO注釋分析

選擇已經(jīng)有實驗驗證的“M”或“T”為靶標(biāo)，共篩選出174個結(jié)腸癌的靶標(biāo)基因。GO（Gene Ontology）注釋結(jié)果見圖1，174 個靶點主要參與negative regulation of apoptotic process（凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)）、positive regulation of gene expression（基因表達(dá)的正調(diào)控）、positive regulation of protein phosphorylation（蛋白磷酸化的正調(diào)控）和positive regulation of cell proliferation（細(xì)胞增殖的正調(diào)控）等生物過程；174 個靶點主要分布在extracellular space（細(xì)胞外間隙）、cytosol（胞質(zhì)溶膠）、extracellular exosome、nucleoplasm（核質(zhì)）和cytoplasm（細(xì)胞質(zhì)）等；174 個靶點主要有enzyme binding（酶結(jié)合）、transcription factor binding（轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合）、protein binding（蛋白質(zhì)結(jié)合）、protein kinase binding（蛋白激酶結(jié)合）和chromatin binding（染色質(zhì)結(jié)合）等分子功能。見圖1。

2.2 結(jié)腸癌Hub靶點分析

174 個結(jié)腸癌靶點通過STRING 進(jìn)行相互作用分析，基于Cytoscape 3.5.1 中的CytoHubba 中的Degree、MNC、MCC和Stress四種算法輸出前10個Hub基因，見圖2。采用FunRich 3.0 軟件繪制結(jié)腸癌Hub 靶點的韋恩圖，通過取交集的方法獲取7 個Hub 靶點：腫瘤壞死因子（TNF）、p53 腫瘤蛋白（TP53）、原癌基因MYC 蛋白（MYC）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP9）和轉(zhuǎn)錄因子AP－1（JUN）。

圖2 關(guān)鍵靶標(biāo)篩選

2.3 關(guān)鍵基因在結(jié)腸癌組織和正常組織中的表達(dá)

TCGA 數(shù)據(jù)中刪除臨床信息和預(yù)后信息不完整樣本，保留473 例結(jié)腸癌樣品和41 例癌旁組織樣品，將TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9、EGFR、TNF mRNA 表達(dá)值平均分為2份，數(shù)值從小到大依次為低表達(dá)和高表達(dá)。TNF mRNA 表達(dá)值在結(jié)腸癌組織和正常組織中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9 mRNA 表達(dá)值在結(jié)腸癌組織中顯著高于正常組織（P≤0.01）；EGFR mRNA 表達(dá)值在結(jié)腸癌組織中顯著低于正常組織（P＜0.01）。見圖3。

圖3 關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)

2.4 關(guān)鍵基因的表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)系

TNF mRNA 表達(dá)值在結(jié)腸癌患者中無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），將不進(jìn)行預(yù)后研究。為明確TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9、EGFR 表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后之間的關(guān)系。運(yùn)用Kaplan－Meier 模型進(jìn)行分析。TP53、MYC、VEGFA、JUN、MMP9、EGFR 表達(dá)水平在總生存率（overall survival，OS）中與結(jié)腸癌患者預(yù)后情況無關(guān)（Log－rankP＞0.05）；TP53、MYC、JUN、MMP9 表達(dá)水平在無病生存率（disease－free survival，DFS）中與結(jié)腸癌患者預(yù)后情況無關(guān)（Log－rankP＞0.05）；EGFR 表達(dá)水平在DFS 中與結(jié)腸癌患預(yù)后情況顯著相關(guān)（Log－rankP= 0.036）；VEGFA 表達(dá)水平在DFS 中與結(jié)腸癌患預(yù)后情況顯著相關(guān)（Log－rankP=0.016）。見圖4。

圖4 不同基因的總生存率和無疾病進(jìn)展生存率

2.5 EGFR、VEGFA表達(dá)量與臨床病理參數(shù)相關(guān)性

EGFR、VEGFA 基因表達(dá)與預(yù)后有一定相關(guān)性（P ＜0.05），將進(jìn)一步探討EGFR、VEGFA 表達(dá)量與COAD臨床分期（stage）和T、N、M分期的相關(guān)性。臨床分期結(jié)果顯示：EGFR基因表達(dá)量與COAD臨床分期無顯著相關(guān)性（P=0.064）；VEGFA 基因表達(dá)量與COAD臨床分期具有顯著相關(guān)性（P=0.006）。見圖5。T 分期、N 分期和M 分期結(jié)果顯示：EGFR 基因的表達(dá)量與T 分期、N 分期和M 分期無顯著相關(guān)性；VEGFA 基因的表達(dá)量與N 分期呈顯著正相關(guān)，N1 和N2 期COAD 組織中VEGFA的基因表達(dá)量顯著高于N0期（P ＜0.05）。見圖6。

圖5 EGFR、VEGFA基因表達(dá)量與COAD臨床分期的相關(guān)性

圖6 EGFR、VEGFA基因表達(dá)與COAD臨床病理特征的相關(guān)性

2.6 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

EGFR 基因的表達(dá)量與臨床病理參數(shù)相關(guān)性差異不顯著（P＞0.05），將不進(jìn)行預(yù)后的單因素分析和多因素分析。故本研究只進(jìn)行VEGFA 在結(jié)腸癌患者中表達(dá)的單因素和多因素分析。單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡、臨床分期及T、N、M 分期能夠影響患者的預(yù)后（P＜0.05），VEGFA 表達(dá)狀態(tài)和性別對預(yù)后沒有明顯影響。見表1。以上因素納入COX 多因素回歸分析，結(jié)果提示年齡、T 分期是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05）。

表1 VEGFA在結(jié)腸癌患者中表達(dá)的單因素分析和多因素分析

2.7 分子對接

通過TCGA 分析發(fā)現(xiàn)VEGFA 與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后關(guān)系密切，基于TCMSP 下載薏苡仁化學(xué)成分38 個，其中16 個化學(xué)成分與VEGFA 有較好的結(jié)合（T_Score ＞5），薏苡仁內(nèi)酯與VEGFA 的結(jié)合分?jǐn)?shù)最高，為6.6。見表2。

表2 化學(xué)成分與VEGFA分子對接結(jié)果

3 討論

本次研究分析了來自TCGA 數(shù)據(jù)庫的結(jié)腸癌mRNA 數(shù)據(jù)，共納入514 例樣本。根據(jù)VEGFA mRNA的中位表達(dá)量，將研究對象分為VEGFA 高表達(dá)及低表達(dá)兩組。主要分析結(jié)腸癌中VEGFA 表達(dá)與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。VEGFA mRNA 在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)量與N分期呈正相關(guān)，進(jìn)一步揭示了結(jié)腸癌患者VEGFA 表達(dá)量與預(yù)后的關(guān)系，繪制Kaplan－Meier 生存函數(shù)曲線，結(jié)果提示VEGFA mRNA 高表達(dá)組與低表達(dá)組DFS 的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。單因素分析發(fā)現(xiàn)，年齡、臨床分期及T、N、M 分期能夠影響結(jié)腸癌患者的預(yù)后（P＜0.05），性別和VEGFA 表達(dá)狀態(tài)與結(jié)腸癌患者預(yù)后無相關(guān)性（P＞0.05）；COX 多因素回歸分析結(jié)果提示，年齡、T 分期是影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05）。

結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，包括腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，與血管的生成密切相關(guān)，其過程中多種因子參與的信號通路起到一定作用［9］。VEGFA 表達(dá)水平在DFS中與結(jié)腸癌患預(yù)后情況顯著相關(guān)。VEGFA 又稱為血管通透因子，是血管生長因子VEGF 的一類重要亞型，為血管生成促進(jìn)因子，影響器官的發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、組織再生、內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管滲透等［10］。有研究表明在結(jié)腸癌患者中VEGFA 過表達(dá)與血管生成以及腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11］，而且有研究發(fā)現(xiàn)，很多實體瘤中VEGFA/VEGFR2信號可以誘導(dǎo)腫瘤的血管生成，其中包括結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌和胃癌等［12-13］，也有一些抑制劑Vatalanib、Cabozantinib、Foretinib 能夠通過抑制VEGF的表達(dá)，控制腫瘤血管生長的過程［14-16］。本研究揭示VEGFA 基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義，為進(jìn)一步探討VEGFA 在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中的作用提供理論依據(jù)。

目前，結(jié)腸癌患者死亡多數(shù)與復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。但是臨床上結(jié)腸癌的靶向治療處于初級階段，因此，掌握結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)特征及關(guān)鍵靶點，可更好地為開發(fā)抗結(jié)腸癌藥物提供理論依據(jù)。本研究對TCGA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，揭示VEGFA 基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義，為進(jìn)一步探討VEGFA在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后提供理論依據(jù)。但是，本研究研究的樣本量數(shù)量有限，僅mRNA 水平探討VEGFA 基因在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)及預(yù)后作用，后期將進(jìn)一步采用蛋白印記或免疫組化在蛋白水平上進(jìn)行深入研究。