姜黃素在海仁藻酸致癇小鼠海馬損傷中的作用

吳連連，秦瀅，胡安康

（徐州醫科大學，江蘇 徐州 221004）

癲癇是一種以大腦異常放電為特征的神經系統疾病，伴隨著大腦內部一系列顯著的變化，如海馬功能障礙，主要表現為神經退行性變、神經發生異常等［1］。姜黃素是一種小分子多酚化合物，主要提取自姜科植物的根莖，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多方面的藥理作用［2］，被廣泛應用于多種疾病的防治。研究顯示姜黃素在腦缺血和外傷性腦損傷中具有顯著的神經保護的作用［3－4］。本研究旨在探究姜黃素對海仁藻酸（kainic aciq，KA）誘導的癲癇海馬神經損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57/BL6雄性小鼠45只，10～12周齡，體質量20～22 g，由徐州醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2020－0011。在溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%、燈光12 h/12 h 晝/夜控制的SPF 環境中飼養，小鼠能自由攝食及飲水。

1.2 試劑與儀器

KA、BrdU、姜黃素（美國Sigma－Aldrich 公司）；尼氏染色液（碧云天生物技術有限公司）；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（紅色熒光）（大連美侖生物技術有限公司）；大鼠抗BrdU 抗體、兔抗Cleaved Caspase－3 抗體、山羊抗大鼠IgG H&L（FITC）（英國Abcam 公司）；兔抗Bax 抗體、兔抗Bcl－2 抗體（美國proteintech公司）；IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG（H+L）（VICMED公司）；徠卡冰凍切片機（CM1950）；日本OLYMPUS 正置熒光顯微鏡（BX53）；美國Li－Cor 公司的Odyssey CLX雙紅外激光成像系統。

1.3 癲癇模型制備

45 只小鼠隨機分為模型組、對照組和姜黃素組3組，每組15只。模型組小鼠腹腔注射KA（25 mg/kg）建立癲癇模型，KA 提前用生理鹽水溶解配置成1 mg/mL的濃度；對照組腹腔注射等量的生理鹽水；姜黃素組小鼠在KA 給藥前12 h 按400 mg/kg 劑量腹腔注射姜黃素，姜黃素提前用少量DMSO 助溶。觀察3 組小鼠行為變化，根據Racine 分級標準［5］進行評價。Racine 分級標準：0 級，行為正常；Ⅰ級，面部肌肉痙攣，表現為眨眼、咀嚼、動須運動等以及濕狗樣顫動；Ⅱ級，頸部肌肉痙攣，表現為點頭運動；Ⅲ級，單側前肢陣攣；Ⅳ級，站立伴有雙前肢陣攣；Ⅴ級，身體失去平衡倒下，四肢持續抽動。小鼠癥狀達到Ⅲ級及其以上，且連續發作30 min 以上時，可視為癲癇造模成功；發作達1 h 給與10%水合氯醛腹腔注射以終止發作。

1.4 尼氏染色

癲癇造模后24 h，小鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉（0.35 mL/100 g），打開胸腔暴露心臟，經左心室插入灌注針，灌注4 ℃生理鹽水，待肝、肺臟顏色轉白，右心室流出的液體澄清無血時，灌注4%多聚甲醛直至小鼠身體變硬，斷頭取腦，多聚甲醛中固定過夜，替換至30%蔗糖中脫水直至腦組織沉底。進行冰凍切片，切片厚10 μm。4 ℃冰凍切片經4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水洗滌2 次，再次換新鮮蒸餾水洗滌2 次，尼氏染色液室溫染色10 min，經蒸餾水洗滌2 次，過95%乙醇約5 s，70%乙醇洗滌2 次，封片晾干后顯微鏡下觀察拍照。

1.5 TUNEL染色

切片經4%多聚甲醛固定，室溫下30 min，PBS 緩沖液洗滌3次。用PBS按照1∶100的比例稀釋Proteinase K（2 mg/mL），使其終濃度為20 μg/mL，每個組織樣本滴加稀釋好的Proteinase K，室溫孵育10 min 后經PBA洗滌。滴加TUNEL 檢測液于37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌后封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 Western blot法檢測

海馬組織加入適量的蛋白裂解液，勻漿器勻漿，靜置15 min，4 ℃，8 000 rpm × 20 min 離心，吸取上清。BCA法測定蛋白濃度，加入相應量的4×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min 處理蛋白。等量蛋白樣品經10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離后，用濕轉法轉移至NC 膜上。經5%BSA 封閉后加入抗體，Cleaved Caspase－3 抗體（1∶1 500），Bax 抗體（1∶500），Bcl－2 抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜。洗滌后加入相應的二抗（1∶5 000），室溫避光孵育1 h；洗膜。Odyssey激光成像系統掃描，結果以圖像處理儀分析處理。

1.7 BrdU免疫熒光染色

先配制好10 mg/mL 的BrdU 溶液，按預設的時間點給各組小鼠進行BrdU 腹腔注射。給藥劑量為每次50 mg/kg，腹腔注射6 次，每12 h 給1 次，連續3 d，最后一次注射24 h 后灌注固定取腦。小鼠經4%多聚甲醛灌注固定，取腦，固定過夜。經30%蔗糖脫水沉糖，進行冰凍切片，切片厚20 μm，先以2 mol/L的HCl溶液處理使DNA 變性，于37 ℃放置30 min，以pH 值8.5 的0.1 mol/L 硼酸在室溫環境中和10 min，10%山羊血清室溫封閉40 min，滴加一抗，BrdU 抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜。滴加熒光二抗（1∶100）孵育1.5 h，封片并于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 統計學分析

利用圖像分析軟件和Photoshop 5.0 軟件（Adobe）對圖像進行處理，所有資料用SPSS 16.0 統計軟件處理，以均數± 標準差（±s）表示，組間均數比較用單因素方差分析（One－Way ANOVA），兩組比較用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 癲癇模型評估

根據癲癇發作等級標準，模型組小鼠癲癇發作達到3 級及以上的有14 只，只有1 只未達3 級；姜黃素組發作等級達3 級的有4 只，11 只未達3 級。經t檢驗分析，差異有統計學意義（F= 38.34，P= 0.009 7）。見表1。

表1 各組癲癇小鼠判定結果（只）

2.2 尼氏染色評定神經元損傷

尼氏染色結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠海馬CA1 和CA3 區的神經元出現顯著損傷，神經元數量顯著減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，姜黃素組CA1 和CA3 神經元損傷減輕，神經元數量顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1，表2。

表2 各組尼氏染色CA1區和CA3區神經元數量比較（±s）

表2 各組尼氏染色CA1區和CA3區神經元數量比較（±s）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。

組別對照組模型組姜黃素組n4 4 4 CA1區74.00±3.47 41.00±2.10a 69.00±3.72b CA3區126.00±6.36 88.00±3.87a 115.00±7.12b

圖1 各組海馬CA1區和CA3區尼氏染色結果

2.3 TUNEL染色檢測海馬細胞凋亡

TUNEL 染色標記海馬凋亡的神經細胞，結果顯示對照組海馬CA1 區和CA3 區均出現少量凋亡神經細胞，模型組CA1 區和CA3 區凋亡神經細胞數量較對照組顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，姜黃素組凋亡細胞數顯著下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2，表3。

圖2 各組海馬CA1和CA3區TUNEL染色結果

表3 各組CA1區和CA3區TUNEL陽性細胞數量比例比較（±s，%）

表3 各組CA1區和CA3區TUNEL陽性細胞數量比例比較（±s，%）

注：與對照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05。

組別對照組模型組姜黃素組n4 4 4 CA1區9.48±0.45 33.10±2.33a 16.54±1.02b CA3區9.16±0.76 44.22±2.87a 23.71±2.17b

2.4 凋亡蛋白表達水平

模型組海馬凋亡蛋白Cleaved Caspase－3 和Bax蛋白相對表達量顯著高于對照組，抗凋亡蛋白Bcl－2相對表達量顯著低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）；姜黃素組凋亡蛋白Cleaved Caspase－3 和Bax 蛋白相對表達量顯著低于模型組，抗凋亡蛋白Bcl－2 相對表達量顯著高于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見圖3，表4。

圖3 Western blot檢測各組海馬組織凋亡蛋白

表4 各組蛋白相對表達量的比較（±s）

表4 各組蛋白相對表達量的比較（±s）

注：與對照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.01。

組別對照組模型組姜黃素組n4 4 4 Cleaved Caspase－3 0.19±0.01 0.71±0.04a 0.26±0.02b Bax 0.12±0.01 0.74±0.30a 0.17±0.02b Bcl－2 0.46±0.03 0.10±0.01a 0.41±0.02b

2.5 BrdU染色檢測海馬細胞增殖

經BrdU 熒光染色標記DG 區新增殖細胞，結果顯示與對照組比較，模型組DG 區BrdU 陽性細胞數顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；姜黃素組BrdU陽性細胞數量顯著低于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4，表5。

圖4 各組DG區BrdU熒光染色圖

表5 各組DG區BrdU陽性細胞數的比較（±s）

表5 各組DG區BrdU陽性細胞數的比較（±s）

注：與對照組比較，aP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05。

組別對照組模型組姜黃素組n4 4 4 BrdU陽性細胞數30.00±2.10 98.00±4.55a 51.00±3.98b

3 討論

姜黃素是從姜黃中提取的一種膳食多酚，具有抗氧化、抗炎、抗微生物感染、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用，已被證明在腫瘤、代謝性疾病、動脈粥樣硬化、腸炎等多種疾病中具有治療作用［6］。近年來，姜黃素對一些中樞神經退行性疾病的保護作用已在體內和體外研究中得到證實。

癲癇是一種慢性神經系統疾病，常伴有反復發作。癲癇發作會引起大腦結構和功能的改變，其病理機制仍未確定。一些基于誘發性癲癇模型的實驗研究發現姜黃素可以延緩或完全抑制癲癇發作［7］。海馬是癲癇發作后的易損區，其形態學變化主要表現為CA1 區和CA3 區錐體細胞的不同程度的受損和凋亡，神經元數的大量減少［8］。并且，在顳葉癲癇患者海馬中也出現海馬神經元丟失的情況，以CAl 區和CA3 區丟失最顯著［9］。Caspase－3 是在細胞凋亡中起關鍵作用的調節蛋白，屬于凋亡執行者。當接受到凋亡信號時會被剪切成有活性的Cleaved Caspase－3，導致核DNA 鏈斷裂，細胞結構解體，出現細胞死亡［10－11］。此外，Bcl－2與Bax 也是凋亡過程中的一對功能相互對立的重要基因，可作為Caspase－3的上游調控基因，協助完成細胞凋亡的調控行為［12］。

本研究通過KA 誘導小鼠癲癇急性發作模型，觀察了姜黃素在癲癇引起的海馬損傷中的作用，發現癲癇發作后海馬CA1 區和CA3 區出現明顯的神經元丟失損傷，凋亡細胞數顯著增加，而姜黃素治療組卻能極大地改善此種現象，神經元數和凋亡細胞數都趨于正常。模型組海馬Cleaved Caspase－3 和Bax 表達顯著上升，Bcl－2蛋白表達出現明顯下調，姜黃素組凋亡蛋白表達趨于正常水平。以上實驗結果表明，姜黃素可以減輕癲癇造成的海馬神經元損傷和凋亡。

神經發生伴隨在整個生命過程中，是神經干細胞增殖分化，新的神經元不斷生成并整合到海馬體回路的過程，對維持正常的生理功能至關重要。然而，在病理條件下會形成異常神經發生，產生異常的神經回路導致腦功能障礙［13－14］。癲癇發生是在癲癇損傷的最初階段發生的過程，不僅涉及神經元損傷凋亡，還會出現神經發生增加［15］。對嚙齒動物的研究表明，癲癇發作可促進齒狀回亞顆粒帶（SGZ）的細胞增殖和神經發生［16－17］。這種神經前體細胞增殖可能有助于異常神經回路的形成。在本實驗中，以BrdU 標記新增殖細胞，結果顯示模型組SGZ 區增殖細胞數顯著增多，與以往報道一致，提示癲癇發作導致異常神經發生。姜黃素組細胞增殖活性顯著降低，接近對照組，表明姜黃素可以抑制癲癇海馬異常神經發生。

本實驗研究結果表明，姜黃素能減少癲癇海馬神經元損傷和凋亡，抑制神經發生，這提示姜黃素對癲癇發作引起的一系列海馬損傷能起到一定的保護作用。