基于牡丹皮微觀性狀與抗炎活性相關的“辨狀論質”研究

陳依婷，王冰，孫艷濤，王詩雨，吳俊英

（遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600）

“辨狀論質”是指根據藥材性狀的特點判斷藥材的真偽優劣［1］。中藥的“狀”既包括宏觀特征，如中藥材的形、色、表面和質地等，也包括微觀特征，即中藥顯微特征［2］。目前國內外“辨狀論質”機制的研究較少，囊括的藥材僅30余種，大多基于藥材的宏觀特征，運用感官技術來進行“辨狀論質”研究［3－5］。質量評價方面，大多是研究藥材性狀與所含化學成分含量之間相關性［6］，而一種或幾種化學成分的活性并不能完全代表藥材的整體藥效，因此根據活性成分的含量判斷中藥質量有一定的片面性。本實驗選擇牡丹皮為研究對象，通過研究其顯微特征和抗炎藥理活性，考察二者之間存在的相關性，為牡丹皮“辨狀論質”研究提供參考依據。

牡丹皮為毛茛科芍藥屬植物牡丹（Paeonia suffruticaosaAndr.）的干燥根皮［7］。牡丹皮有清熱涼血、活血化瘀的功效，可令血流暢而不留瘀，血熱清而不妄行，用于熱入營血、溫毒發斑、吐血和衄血等［8］。臨床也可用于降血糖、抗菌消炎、抗動脈粥樣硬化等［9］。當前國內有關牡丹皮“辨狀論質”機制的研究甚少，國外對牡丹皮的研究多是基于內生細菌的多樣性分析、對牡丹皮代謝產物進行質量評價等［10－11］，未見涉及牡丹皮“辨狀論質”的研究。牡丹皮粉性足，氣芳香，其所含淀粉粒及草酸鈣簇晶眾多，且簇晶直徑9～45 μm，排列成行，是牡丹皮最具特色的顯微特征［12］。前期實驗發現，牡丹皮粉末中草酸鈣簇晶顯微特征明顯且易于計數［13］，極具代表性。牡丹皮的抗炎活性現代應用較為廣泛［14］，因此本實驗選擇抗炎活性作為牡丹皮藥效的研究。通過對二者的相關性分析，揭示牡丹皮基于微觀性狀與抗炎活性的“辨狀論質”內涵。

1 儀器與試材

1.1 儀器

生物顯微鏡（Nikon E100）；TD 型電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）；高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；微量移液器（Thermo 賽默飛F2系列單道移液器）；足腫脹測定儀（KW－7C）；軟尺。

1.2 主要試劑

水合氯醛（天津大茂化學試劑廠，批號：302－17－0，分析純）；甘油（商丘圣邦生物科技有限公司，批號：190202）；角叉菜膠（Simga，批號：127H1227）；乙酰水楊酸（純度＞91%，HPLC）由遼寧中醫藥大學有機化學實驗室提供。

1.3 實驗材料

牡丹皮藥材經遼寧中醫藥大學藥學院康廷國教授鑒定均為正品藥材，見表1。健康小鼠250 只，雌雄各半，體質量18～22 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證編號：SCXK（遼）2020－0001。

表1 22批牡丹皮藥材產地

2 方法與結果

2.1 牡丹皮的顯微特征

2.1.1 均勻設計實驗

采用三因素六水平均勻設計實驗來確定最佳實驗條件，見表2。取1號牡丹皮藥材粉碎，按均勻設計實驗表分別過80目、100目篩，精密稱定50、80、120、150、180、200 mg共6份樣品于10 mL容量瓶中，加入相應的甘油量后，用水合氯醛定容，搖勻，用微量移液器吸取50 μL于載玻片上，蓋好蓋玻片。6份溶液各平行裝片50張，在生物顯微鏡下觀察簇晶并計數。將所得結果平均分為5組并取平均值，計算每組平均值的RSD，見表3。

表2 均勻設計實驗表

表3 均勻設計結果

設Y為RSD%值，X1為樣品重量，X2為藥材粉碎粒度，X3為甘油量。根據均勻設計結果可得：Y=117.760－0.937X2，R= 0.966，F= 55.063，Ymin =24.06。由此可知，影響RSD值的主要因素為X2粉碎粒度，X1、X3與Y無明顯相關性，可依實驗情況而定。為降低RSD值，最佳水平組合條件為：樣品重量120 mg，粉碎粒度100目，加入甘油2 mL。

2.1.2 牡丹皮中顯微特征指數的測定

取22 批牡丹皮藥材粉末過100 目篩，精密稱定120 mg藥粉于10 mL容量瓶中，精密加入2 mL甘油，用水合氯醛定容，搖勻，用微量移液器吸取50 μL 于載玻片上，蓋好蓋玻片，每份溶液平行紙片50 張，于顯微鏡下觀察簇晶，計數，所得結果分為5組并取每組平均值，按照公式（1）計算［15］，結果用均數±標準差（±s）表示，所得數據見表4。可以看出個別批次的牡丹皮顯微特征指數明顯較高，有的牡丹皮顯微特征指數區間相近。

表4 牡丹皮顯微特征指數測定結果（±s）

表4 牡丹皮顯微特征指數測定結果（±s）

樣品號顯微特征指數（個/mg）顯微特征指數（個/mg）1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 343±270 1 307±289 1 632±190 1 484±278 1 088±285 1 276±260 1 396±338 1 293±276 1 361±313 1 305±224 1 523±321樣品號12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 706±309 1 831±217 2 188±433 1 445±257 2 016±407 1 636±343 2 681±663 1 856±170 2 023±319 1 461±332 1 597±293

其中，P：定量藥材顯微特征指數（個/mg）；X：每片蓋玻片下藥材顯微特征數；V：定量藥材混懸液總體積（mL）；V'：蓋玻片下藥材混懸液體積（mL）；W：藥材重量（mg，按干燥品計）。

2.1.3 牡丹皮簇晶數據聚類分析

以簇晶數據為變量，采用系統聚類法對不同來源的牡丹皮進行聚類分析，所得垂直冰柱圖見圖1。

圖1 牡丹皮簇晶數據垂直冰柱圖

當群集數為5時，22批牡丹皮被劃分為5類：第Ⅰ類群包括11個品種，編號分別為1、2、4、6、7、8、9、10、11、15、21；第Ⅱ類群僅1 個品種，編號為5；第Ⅲ類群包括6 個品種，編號分別為3、12、13、17、19、22；第Ⅳ類群包3個品種，編號分別為14、16、20；第Ⅴ類群僅1個品種，編號為18。將顯微特征指數測定值與聚類分析結合，按照顯微特征指數測定值高低分出5 個類群的大小排列：Ⅴ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ。

2.2 牡丹皮抗炎活性測定

2.2.1 供試品溶液制備

取22 批牡丹皮藥材適量，分別加5 倍量75%乙醇，回流提取2 次，過濾，合并濾液，減壓濃縮，得到牡丹皮流浸膏［16］。

2.2.2 牡丹皮抗炎情況測定

小鼠250 只，隨機分為25 組，每組10 只，分別為空白組、模型組、給藥組1～22組和陽性組［17］。其中，各給藥組小鼠分別灌胃給予22 批牡丹皮提取液0.6 g/mL，陽性組小鼠灌胃陽性對照品阿司匹林溶液0.125 g/mL［18］。連續灌胃4 d，最后1次灌胃40 min后，除空白組外，對其余各組小鼠采用左后足趾處注射1%角叉菜膠混懸液0.05 mL 的方法建立炎性小鼠模型［19］，空白組小鼠于同部位注射等量生理鹽水。于造模前及造模5、30 min和1、2、4 h后測量各組小鼠左足踝關下0.5 mm 處的周長［20］。足腫脹抑制率用造模后相對于造模前周長的增加值表示［21］。結果見表5，可以看出個別牡丹皮的抑制率較高，有的牡丹皮的抑制率區間相近。

表5 不同批牡丹皮足腫脹抑制率結果（±s）

表5 不同批牡丹皮足腫脹抑制率結果（±s）

樣品號1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11抑制率（%）39.54±31.82 39.80±36.97 46.11±26.90 75.04±17.88 63.48±20.13 68.84±26.24 73.71±36.23 31.80±39.73 81.61±49.81 49.95±26.61 61.74±19.09樣品號12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22抑制率（%）58.93±22.94 65.51±23.69 60.72±26.27 60.76±39.04 80.89±24.69 73.27±33.00 97.76±37.50 52.59±25.84 96.41±19.36 60.86±34.06 89.14±24.62

足腫脹抑制率=（對照組足平均腫脹度－給藥組足平均腫脹度）/對照組足平均腫脹度×100%

2.2.3 牡丹皮抗炎情況聚類分析

以抗炎數據為變量，采用系統聚類法對不同產地的牡丹皮進行聚類分析，所得垂直冰柱圖如圖2所示。

圖2 牡丹皮抗炎情況垂直冰柱圖

當群集數為5時，22批牡丹皮被劃分為5類：第Ⅰ類群包括3 個品種，編號分別為1、2、8；第Ⅱ類群包括3個品種，編號為3、10、19；第Ⅲ類群包括11個品種，編號分別為4、7、17、6、5、13、11、14、15、21、12；第Ⅳ類群包括3 個品種，編號分別為9、16、22；第Ⅴ類群包括2 個品種，編號為18、20。將足腫脹抑制率數值與聚類分析結合，按照足腫脹抑制率高低分出5 個類群的大小排列：Ⅴ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ。

2.3 牡丹皮簇晶顯微特征指數與抗炎藥效相關性研究

運用SPSS 17.0 軟件，對簇晶顯微特征指數與足腫脹抑制率進行Pearson 相關性分析，結果如下：相關系數R= 0.518，變量呈中等程度正相關；P= 0.007 ＜0.01，變量相關性顯著。可以看出不同來源牡丹皮藥材簇晶顯微特征指數與其足腫脹抑制率呈顯著中等程度正相關，即簇晶顯微特征指數越大，足腫脹抑制率越高。

3 小結與討論

本實驗基于牡丹皮顯微特征（簇晶）與抗炎活性的相關性分析來評價闡釋“辨狀論質”理論機制。相關性分析結果中，不同來源牡丹皮中簇晶顯微特征指數與抗炎活性有較顯著的相關性，呈中度正相關，中藥的藥理活性直接反映藥材的優劣，說明牡丹皮簇晶的顯微特征指數可作為判斷藥材品質優劣的參考指標。聚類分析結果中，山東青島的牡丹皮藥材（編號18）中簇晶的顯微特征常數明顯多于其他來源，其抗炎藥理作用也較其他來源的牡丹皮較為顯著，說明產于山東青島的牡丹皮品質較優，在牡丹皮的使用中可以優先考慮該來源。其余的21 個品種中，相同產地的大都分為一類，說明來源相同的牡丹皮質量基本保持一致。

本實驗對微觀性狀－簇晶進行了研究，拓展了中藥“辨狀論質”理論中“狀”的范圍，即中藥的“狀”既包括藥材宏觀性狀，也應包括微觀性狀，即藥材的顯微特征。通過“狀－效”關聯研究，表明藥材的顯微特征與藥理活性存在關聯，可以通過定性定量測定藥材性狀判別藥材品質，可為中藥“辨狀論質”科學內涵的研究提供參考依據。