振腹環揉法對PCPA失眠大鼠下丘腦、血清、小腸中SP含量的影響*

張 野，叢德毓，董 娜，施聰聰，趙家君，張紅石

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

失眠是比較常見的睡眠障礙，病程較緩且長，近半數可以持續十年以上[1]，同時普遍發病，嚴重影響人們身體健康，常常是心血管、腦血管以及內分泌類疾病的誘導因素，給社會工作和家庭生活帶來不便和困擾。國際睡眠醫學指南對于失眠癥的診療論述雖然較全面，但是較少關注中醫物理療法的相關內容，尤其目前關于推拿治療失眠癥的機制研究不足，難以作為證據支撐其有效性。而對于腦腸肽與失眠關系的研究，則有可能成為闡釋推拿治療失眠的發病機制突破點。

P物質(substance p，SP)是激素肽家族的其中一種，是以激素的形式廣泛分布于消化系統中，并且以神經遞質的形式分布于中樞系統，類屬于腦腸肽。有研究表明在大鼠側腦室注射SP，可以增加睡眠時間，屬于中樞性促眠物質[2]。在胃腸運動有明顯的促進作用，有研究表明SP可引起胃腸道平滑肌收縮[3]，SP是一種參與腦腸互動系統的神經肽。且在杏仁核、導水管周圍灰質以及下丘腦等負責調節情緒的腦區分布較豐富，同時在初級感覺神經元的胞體及神經纖維上有較高表達[4]。是一種存在于中樞性的促促進睡眠的物質，但必須通過睡眠中樞介導[5]。所以腹部推拿是可能通過促進胃腸道活動，影響SP等物質分泌，并改善中樞神經系統對睡眠的調控。

振腹環揉法是基于長白山通經調臟手法流派的“通經調臟”理論發展而來的一種推拿手法，以腹治腦，以腸調神為目的，通過對腹部的振動和環揉治療相關疾病[6]。振腹環揉法治療失眠具有豐富的臨床實踐，療效顯著。所以試通過分析振腹環揉法推拿對于PCPA失眠大鼠模型的不同取材和不同治療時間的SP含量差異，探討SP與振腹環揉法之間關系，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 取成年SD大鼠48只，雌雄各半，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司(生產許可證號：SCXK(吉)-2015-0005)，隨機分為4組，每組12只，空白組不造模不治療，模型組PCPA法造模后不干預；推拿組PCPA法造模通過振腹環揉推拿干預10 d，藥物組PCPA法造模后給予歸脾丸灌胃10 d。

1.2 主要儀器和試劑 D-4-綠本丙氨酸(麥克林CSA：7424-00-2)；戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；碳酸氫鈉(成都市科龍化工試劑廠)；阿拉伯樹膠粉(天津市光復精細化工研究所，津Q/HG NK 204-2000)大鼠SP酶聯免疫試劑盒(48T，血清、血漿，南京建成)；大鼠SP酶聯免疫試劑盒(96T，組織勻漿，南京建成)；組織勻漿器(塞維爾)；低溫高速離心機(Versati M22R)；酶標儀(SYNERGY)。

1.2.1 模型建立 PCPA失眠大鼠模型建立：用碳酸氫鈉和純水配成5%弱堿性溶液，將碳酸氫鈉溶液滴入到0.9%氯化鈉溶液中，制備成弱堿性的生理鹽水(溫度10℃～40℃為宜)，調節pH為7～8之間備用，按400 mg/kg每只注射2 d的量稱取PCPA粉末，置于研缽中加入少許弱堿性生理鹽水研磨，并加10%阿拉伯膠繼續研磨，按1 mL/100 g在研磨好的PCPA中加入調節好PH值的溶液，定容而成 PCPA混濁液，用超聲機超聲15min。進行大鼠腹腔注射，連續注射2 d。空白組腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.3 行為學觀察 失眠模型成功判定：為了觀察大鼠失眠程度，在首次注射后36 h，采用戊巴比妥鈉翻正實驗對PCPA失眠大鼠模型進行評價，按50 mg/mL的比例將戊巴比妥鈉溶于生理鹽水中備用，給予每只大鼠劑量為35 mg/kg的戊巴比妥鈉，然后記錄大鼠翻正反射消失時間[7]，以及大鼠睡眠持續時間。將空白組與模型組進行比較，具有統計學差異則證明模型成功。

1.4 自發活動試驗 主要是根據大鼠舉爪行為活動程度觀察大鼠神經興奮程度，在試驗前將大鼠分別在的各自鼠籠中適應3 min，保持環境穩定，然后開始記錄大鼠在2 min之內的前肢舉爪離地次數作為活動指標。分別在造模前、造模后、末次治療后1 h進行測試。

1.5 干預方法

1.5.1 空白組 給予正常飲水和食物，腹腔注射等量生理鹽水，不予以任何干預治療，進行實驗室檢測。

1.5.2 模型組 造模后，每天將實驗大鼠置于束縛鼠板仰臥位1次，不予振腹環揉法推拿，12 min后解開束縛，每天1次，連續操作10 d。

1.5.3 推拿組 采用“振腹法”和“環揉法”進行腹部推拿。在腹部加以震動和環揉的兩個連續手法，采用振動頻率一致、重量統一的穴位震動按摩儀對大鼠進行腹部推拿，穴位震動按摩儀頭端直立于大鼠腹部中脘穴周圍 2×2 cm部位操作，每次震動2 min，然后向下僅依靠按摩儀的重力順時針環揉 15 圈(2 min)，兩種方法交替操作3次，共12 min，每只大鼠每天干預1次，連續治療10 d。

1.5.4 藥物組 造模成功后按照人∶大鼠=1∶30的比例，將藥物劑量按照體重轉化為毫升數，灌服人參歸脾丸，由北京同仁堂股份有限公司生產(生產批號：國藥準字Z11020104)，每日1次，連續灌胃10 d。

1.6 觀察指標 觀察干預前后大鼠睡眠狀態，ELISA法檢測下丘腦、血清、小腸中SP的含量。干預5 d后上午10點對各組前6只大鼠取材，治療10 d后上午10點剩余大鼠取材。從大鼠腹主動脈取出血液樣本，用3000 rpm離心機離心15 min，取上清液分裝備用。取血后將下丘腦和小腸組織從大鼠體內取出，迅速液氮冷凍，保存在-80℃冰箱中，用量按比1 g∶9 mL的比例，加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)使用勻漿機將標本充分勻漿，以3000 rpm離心機離心15 min，取上清液備用。用酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進行檢測，嚴格按照說明書進行。

2 結果

2.1 建模后結果 48只隨機分為空白對照組，模型組、推拿組、藥物組，每組12只，造模后模型組、推拿組、藥物組分別與空白組比較翻正反射消失時間，皆有所延長(P<0.01)；模型組、推拿組、藥物組3組造模后翻正反射消失時間比較差異無統計學意義(P>0.05)；造模后模型組、推拿組、藥物組分別與空白組比較翻正反射消失時間，皆有所縮短(P<0.01)；模型組、推拿組、藥物組3組造模后翻正反射消失時間比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示PCPA失眠大鼠模型造模成功，可以進行實驗。見圖1。

圖1 各組大鼠造模前后翻正反射消失時間比較

2.2 干預后結果 造模后各組大鼠具有腹部糞便堆積現象，模型組出現斑禿現象。治療后推拿組與藥物組大鼠睡眠狀態均改善，睡眠時間延長廝斗現象減少，脫發程度明顯小于模型組，腹部推拿過程中大鼠會有較多大便排出。觀察自發舉爪次數結果顯示，模型組與空白組比較，明顯舉爪次數多，且差異有統計學意義(P<0.01)，推拿組與模型組比較舉爪次數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)，藥物組與模型組比較舉爪次數也減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。通過ELISA實驗檢測治療5 d和治療10 d各組大鼠下丘腦、血清、小腸中SP濃度。下丘腦SP含量第5 d與第10 d比較模型組、推拿組、藥物組血清SP含量均升高，且有統計學意義(P<0.05)，治療第10 d后，推拿組和藥物組與模型組比較，SP含量上升更為顯著，差異有統計學意義(P<0.01)。大鼠血清SP含量第5 d與第10 d比較，模型組、推拿組、藥物組血清含量均顯著增高，且差異有統計學意義(P<0.01)，干預第10 d后，推拿組和藥物組與模型組比較，SP含量上升更為顯著，差異有統計學意義(P<0.01)。PCPA失眠大鼠小腸SP含量第5 d和第10 d比較，模型組、推拿組、藥物組小腸SP含量增高，且差異有統計學意義(P<0.05)，干預第10 d后，推拿組SP含量上升更為顯著，差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖2 大鼠自發舉爪次數

圖3 干預5 d和10 d大鼠下丘腦、血清、小腸中SP含量水平(n=6)

3 討論

失眠亦稱“不寐”，中醫學多分為心脾兩虛、肝郁化火、心腎不交、痰熱擾神、陰虛火旺等證型。目前現代醫學對其發病機制的研究逐漸深入，很多關于失眠腦腸互動的研究被報道，而神經肽類物質的不斷發現為腦腸互動的機制增加了證據，例如食欲肽、膽囊收縮素、神經肽S、神經肽Y、β-內啡肽、腦啡肽[8]、神經肽Y[9]、血管活性肽[10]等，其中腦腸肽[11]被證明與失眠相關，這類物質不僅存在和常產生于腦內，在胃腸道也有大量存在，發揮調節腦腸互動作用，不僅能調節胃腸道消化吸收功能，也能調節睡眠，這與中醫學“胃不和則臥不安”的理論有相關之處，p物質[6]亦為其中重要的一種。

《靈樞經》記載“十二經脈，三百六十五絡，其氣皆上于面而走空竅”，腹部分布有諸多經脈，且腹下有諸多臟器，與全身機能密切相關，長白山通經調臟手法流派經過傳承實踐，據此提出“以腹治腦，以腸調神”的治療思想。振腹環揉法則是這一理論指導下的實踐應用，治療失眠療效果明顯。在此臨床有效性研究基礎之上，腦-腸軸互動理論的研究為之提供了切實的理論依據，由于腦腸肽的發現，腦和胃腸的功能相關更加明確[12]。研究發現，多種腦腸多肽類物質與其調控睡眠的功能密切相關，P物質(substance p，SP)則是之一，SP是感覺神經肽，在調控干細胞分化中扮演了重要角色，在中樞神經系統和胃腸系統中都有分布[13]，能夠調節腦組織中多種物質的表達水平，在中樞神經系統通過興奮下丘腦阜外測試前區神經元促進睡眠[14]，在胃腸系統中以激素的形式存在，主要起促進胃腸運動的作用[15]。用組間t檢驗比較空白組大鼠5 d和10 d下丘腦、血清、小腸中SP含量，得出差異有統計學意義，而比較模型組、推拿組、藥物組10 d后含量皆高于干預5 d后含量，差異有統計學意義(P<0.05)。用單因素方差分析比較大鼠血清、下丘腦、小腸10 d后SP含量，推拿組皆高于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)，而藥物組雖都有所升高，但是升高程度相對推拿組略低。所以通過實驗說明振腹環揉法可以上調PCPA失眠大鼠血清、下丘腦、小腸中SP含量。此外通過行為學結果觀察，造模后各組大鼠具有腹部糞便堆積現象，模型組出現斑禿現象。在治療后推拿組與藥物組大鼠睡眠狀態均改善，睡眠時間延長廝斗現象減少，脫發程度明顯小于模型組，腹部推拿過程中大鼠會有較多大便排出。觀察自發舉爪次數結果顯示，模型組與空白組比較，明顯舉爪次數多(P<0.01)；推拿組與模型組比較舉爪次數明顯減少，(P<0.01)；藥物組與模型組比較舉爪次數也減少(P<0.05)。說明模型組比空白更易興奮，通過推拿治療后神經興奮性明顯減輕，藥物組與模型組比較也有所減輕，從而證明振腹環揉法能夠改善大鼠失眠癥狀。

4 小結

本實驗通過對比5、10 d后各組大鼠下丘腦、血清、小腸中SP濃度，總結不同部位、不同治療時間的SP變化差異，結果顯示治療10 d后推拿組和藥物組對下丘腦、血清內SP的影響皆較治療10 d后更顯著，推拿組和藥物組呈大致一樣趨勢。推拿和藥物組都能改善大鼠下丘腦、血清、小腸中SP濃度，而推拿組干預10 d后對小腸內SP的影響要比藥物組更顯著。說明無論是腹部推拿或歸脾丸藥物治療，治療10 d的影響皆比治療5 d的影響更明顯，行為學結果表現與SP變化趨勢相對一致。總之振腹環揉法可以上調PCPA失眠大鼠血清、下丘腦、小腸中SP含量并且能夠改善大鼠失眠癥狀。然而本實驗收到樣本量和試驗條件的限制，仍需要設置更為精細的時間節點來觀察不同時段的SP含量變化，并且在未來實驗條件允許情況下或將采用pcr或蛋白組學的檢測方法來明確闡釋和驗證這一試驗結果。