谷氨酰胺酶1對卡介苗誘導的巨噬細胞自噬的調控作用*

嚴 娜， 張 旭， 于嘉霖， 安 琪， 吳曉玲， 鄧光存

（西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021）

結核?。╰uberculosis）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的一種人畜共患傳染病，嚴重威脅人類健康和公共衛生安全［1］。巨噬細胞是Mtb的主要宿主細胞。被Mtb感染后，巨噬細胞響應病原體感染會發生凋亡和自噬為主的清除過程或巨噬細胞壞死的病原逃逸過程；其中，自噬作為細胞的一種“清潔”進程，不僅可以維持體內穩態，還能清除入侵的 Mtb 病原體［2］。自噬在 Mtb 感染中的作用機制復雜，至今還未完全明晰。

研究發現，細胞代謝在免疫反應的啟動和調節中起著至關重要的作用，機體一旦被感染，免疫細胞會重新連接細胞代謝以適應感染，并產生足夠的能量來執行宿主防御功能。谷氨酰胺作為巨噬細胞的主要代謝底物，能夠為巨噬細胞的免疫應答提供能量支持，在宿主防御結核分枝桿菌感染中發揮重要作用［3-4］。此外，谷氨酰胺代謝還可以參與細胞自噬的調節［5］。谷氨酰胺酶1（glutaminase 1，GLS1）將谷氨酰胺轉化為谷氨酸，在谷氨酰胺代謝中起關鍵作用。最近的研究發現，被腺病毒感染的人支氣管上皮細胞中谷氨酰胺利用和GLS1 活性增加，而降低GLS1 的活性能夠抑制病毒的復制［6］。另外，人肺肌成纖維細胞經歷谷氨酰胺分解重編程是由GLS1 表達增加所介導的，GLS1抑制劑CB-839在治療小鼠肺纖維化方面非常有效，GLS1 可能是肺纖維化治療的潛在靶點［7］。然而，GLS1 在 Mtb 感染后巨噬細胞中的作用仍有待闡明。

因此，本研究通過卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）感染小鼠巨噬細胞RAW264.7，誘導其發生自噬，通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）敲減GLS1的表達，并利用 Western blot 和免疫熒光等技術，檢測自噬相關因子表達情況，從而初步探討GLS1 對BCG 誘導的巨噬細胞RAW264.7 自噬的調控作用。上述研究將為結核病的發病及防治機制提供新的思路和見解。

材料和方法

1 RAW264.7細胞培養

RAW264.7 細胞購自中科學院上海細胞研究所。培養步驟：當細胞密度達到80%～90%，吸去培養皿中的培養液，沿壁加入2 mL 的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗三遍，胰酶消化2 min，900 r/min離心5 min。棄去上清，重懸細胞，根據細胞數量，將細胞懸液分配到培養皿中，放入37 ℃、5%CO2細胞培養箱中孵育。

2 BCG培養與感染

BCG 購自上海生物制品研究所。培養步驟：按照配方配制Middlebroook 7H9 肉湯培養基，并加600 μL Tween-80，高壓滅菌，加入增菌劑混勻，挑取菌落，接種于培養瓶中，在培養箱中孵育，待BCG 培養至合適濃度（A600=1.5）后進行傳代。

根據實驗需要從BCG 培養瓶中吸取適量BCG，離心棄上清，用培養液重懸沉淀，計數。按細胞與BCG 個數1∶10 的比例感染，即感染復數（multiplicity of infection，MOI）=10。

3 主要試劑與儀器

無谷氨酰胺DMEM 培養液和高糖DMEM 培養液購自Gibco；小牛血清、胎牛血清和PBS 均購自Biological Industries；Middlebrook 7H9 肉湯培養基購自BD；OADC 增菌劑購自青島海博生物技術有限公司；胰酶購自北京索萊寶科技有限公司；全蛋白酶提取試劑盒購自南京凱基生物科技發展公司；蛋白定量（BCA 法）試劑盒和蛋白marker 購自Thermo Fisher；兔抗鼠LC3B 和GLS1 抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；其他Ⅰ抗和Ⅱ抗均購自Proteintech；熒光Ⅱ抗購自Invitrogen；含DAPI防淬滅熒光封片劑購自中杉金橋公司。凝膠成像系統購自Bio-Rad；Odyssey Sa 雙色紅外激光成像系統購自LI-COR；Enspire熒光酶標儀購自PerkinElmer；熒光光學顯微鏡購自麥克奧迪（Motic）實業集團有限公司。

4 主要方法

4.1 siRNA 的構建及轉染 根據GLS1 序列設計siRNA-GLS1 和siRNA-NC，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，具體序列見表1。取對數生長期的RAW264.7 細胞接種到 6 孔板中，每孔接入 1×106個細胞；貼壁后將轉染試劑（ZETA LIFE）與siRNA按1∶1 混合（6 μL 轉染試劑和6 μL siRNA），室溫放置10～15 min后，入細胞培養板中，24 h后進行后續試驗。

表1 siRNA序列Table 1. siRNA sequences

4.2 免疫熒光檢測 爬片：提前將20 mm 細胞蓋玻片置于12 孔板中，每孔接種5×104個細胞，貼壁后按照實驗設計處理細胞。制片步驟：棄去培養液，4%多聚甲醛固定20 min，1×的PBS 洗三次。0.5% Triton X-100 通透30 min，3%牛血清白蛋白室溫封閉1 h。37 ℃孵育Ⅰ抗（用3%牛血清白蛋白按照1∶200比例稀釋LC3B 抗體）3 h，1×PBS 洗3 次，37 ℃避光孵育熒光Ⅱ抗（用PBS 按照1∶500 稀釋）1 h，最后用含DAPI 的封片劑封片4 ℃保存，使用激光共聚焦顯微鏡觀察LC3的熒光表達并拍照。

4.3 細胞內自噬流檢測 爬片與免疫熒光操作一致。轉染 siRNA 24 h 后，按 mRFP-GFP-LC3 串聯熒光蛋白腺病毒與細胞比例為20∶1加入病毒，2 h后更換培養液，待熒光強度達到最好時，進行BCG 感染，固定，封片。通過熒光顯微鏡成像軟件觀察細胞紅色熒光、綠色熒光及兩者重合后的熒光圖，拍照計數并分析自噬流水平（黃色斑點代表自噬體，紅色斑點代表自噬溶酶體）。

4.4 Western blot 檢測 將RAW264.7 細胞以每孔1×106個細胞接種于6 孔板中，貼壁后處理細胞。使用全蛋白提取試劑盒，按照說明書操作，提取蛋白并用BCA法檢測蛋白濃度。根據需要測定的蛋白大小配制分離膠，將各組蛋白按25 μg 定量上樣并進行SDS-PAGE，然后用濕轉法將蛋白樣品從膠轉移到聚偏二氟乙烯膜（300 mA，2 h）。5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，4 ℃過夜孵育蛋白Ⅰ抗（1∶1 000 比例稀釋βactin、GLS1、LC3B、ATG5、ATG7 和 ATG12 抗體），TBST 洗滌 6 min×5 次，孵育Ⅱ抗 1 h（1∶5 000 稀釋Ⅱ抗），TBST 洗滌。使用化學發光液（ECL 發光）檢測蛋白條帶并通過GE 化學發光檢測儀進行曝光，結果用ImageJ軟件分析。

4.5 谷氨酰胺/谷氨酸檢測實驗 測定谷氨酸/谷氨酰胺含量實驗用ELISA 試劑盒。將處理好的細胞用PBS 洗 2 遍，加入 RIPA 裂解，10 000 r/min 離心 15 min，取上清按照劑盒說明書進行。為了消除細胞數量不同帶來的結果誤差，取裂解好的上清用BCA 定量其蛋白濃度，然后用谷氨酰胺/谷氨酸濃度除以蛋白濃度，得出最終數據。

4.6 流式細胞術檢測自噬率 RAW264.7 細胞接種于6 孔板中，置于細胞培養箱中過夜培養，轉染siRNA，24 h 后按照 MOI=10 的加入 BCG 感染 12 h。棄去完全培養液，PBS 洗 2 次。500 μL 胰酶消化 2 min，加 500 μL 完全培養液終止消化，800 r/min 離心5 min，棄上清。加入500 μL 帶有染料的Assay buffer，輕輕重懸，置于細胞培養箱孵育30 min，800 r/min，離心5 min，棄上清。用1 mL PBS 重懸，上機檢測，采用FlowJo 7.6.1軟件分析細胞自噬數據。詳細操作見CytoID檢測試劑盒說明書。

5 統計學分析

所有數據均以3 個獨立實驗的均數±標準差（mean±SD）表示。使用 GraphPad Prism 9.0 軟件中的One Way ANOVA 進行數據分析，并經過Bonferroni校正。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BCG 感染促進了巨噬細胞自噬標志蛋白LC3B的表達

為探究BCG 感染對RAW264.7 細胞自噬的影響，確定BCG誘導自噬發生的最佳感染條件，我們設置BCG 以不同MOI、不同感染時間感染RAW264.7細胞，利用Western blot 檢測巨噬細胞內自噬標志蛋白LC3B表達情況。Western blot結果顯示，與對照組相比，BCG 感染可促進 LC3B 表達，在 MOI=10、感染時間為12 h時LC3B 的表達量最高，且顯著高于對照組（P＜0.01），見圖 1。因此，我們確定 BCG 誘導RAW264.7 細胞發生自噬的最佳感染條件為MOI=10且感染時間為12 h。

2 BCG感染促進了巨噬細胞內谷氨酰胺分解代謝

為了探究BCG 感染對RAW264.7細胞內谷氨酰胺分解代謝的影響，我們利用Western blot 檢測了BCG 不同MOI、不同感染時間感染RAW264.7 細胞后細胞內谷氨酰胺分解代謝的關鍵酶GLS1 蛋白表達情況。Western blot 結果顯示，BCG 感染可顯著增加GLS1蛋白表達量（P＜0.01），隨著MOI和感染時間的增加，GLS1 的表達出現了先上升后下降的趨勢，在MOI=10、感染時間為12 h 時GLS1 的蛋白表達量最高，見圖2A、B。

我們還通過ELISA 檢測了巨噬細胞內谷氨酰胺和谷氨酸的水平，發現BCG 感染后細胞內谷氨氨酰胺含量顯著降低（P＜0.01），而谷氨酸含量顯著增加（P＜0.01），在感染時間為12 h、MOI=10 時變化最大，見圖2C～F。以上研究結果表明，BCG 感染促進了巨噬細胞內谷氨酰胺分解代謝。

3 敲減GLS1增加了巨噬細胞內谷氨酰胺水平

如圖 3A 所示，與 NC 組相比，BCG 感染可上調RAW264.7 細 胞 GLS1 的 表 達 ；與 BCG 組 相 比 ，siRNA-GLS1+BCG 組中 GLS1 的表達顯著降低（P＜0.01）。如圖3B 所示，敲減GLS1后胞內谷氨酰胺含量顯著增加（P＜0.05）。以上結果表明，敲減GLS1下調了BCG 感染后GLS1 的表達，可用于研究GLS1 在BCG誘導細胞自噬中的作用。

4 敲減GLS1抑制了BCG誘導的巨噬細胞自噬

為探究敲減GLS1對BCG 感染的RAW264.7 細胞自噬的影響，我們利用Western blot 和流式細胞術分別檢測了自噬相關蛋白表達和自噬率。Western blot 結果表明，與 BCG 組相比，siRNA-GLS1+BCG 組LC3B（P＜0.01）、beclin-1（P＜0.01）和 ATG12（P＜0.05）蛋白的表達量顯著降低，見圖4A。流式細胞術結果顯示，與對照組相比，BCG 感染后巨噬細胞自噬率顯著上升（P＜0.01），而敲減GLS1使BCG感染后巨噬細胞自噬率顯著下降（P＜0.05），見圖4B。以上研究結果表明，敲減GLS1對BCG 感染誘導的RAW264.7細胞自噬具有抑制作用。

Figure 1. Effect of BCG infection on the expression of autophagy marker protein LC3B in macrophages. A：the LC3B protein expression in RAW264.7 cells with different multiplicities of infection（MOI）of BCG was detected by Western blot；B：the LC3B protein expression in RAW264.7 cells with BCG infection for different time was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（Con）group.圖1 BCG感染對巨噬細胞自噬標志蛋白LC3B表達的影響

5 剝奪谷氨酰胺對siRNA-GLS1 抑制的巨噬細胞內自噬相關因子的影響

上述研究結果顯示，敲減GLS1顯著增加巨噬細胞內谷氨酰胺的含量，并伴隨自噬的減弱，提示敲減GLS1調控的細胞自噬與細胞內谷氨酰胺含量增加相關，為進一步驗證，將培養液中的谷氨酰胺剝奪再處理細胞，利用Western blot 和免疫熒光檢測了自噬標志蛋白LC3B 的表達。Western blot 和免疫熒光結果均顯示，在正常培養的RAW264.7 細胞中干擾GLS1顯著抑制了BCG 誘導的LC3B 表達（P＜0.05）；剝奪谷氨酰胺處理RAW264.7 細胞后，與BCG 組相比，siRNA-GLS1+BCG 組LC3B 的表達量無著變化，見圖5A、B。

利用 Western blot 檢測 ATG5 和 ATG12 蛋白的表達情況，結果顯示，ATG5和ATG12蛋白表達與LC3B表達結果一致，見圖5C。因此，敲減GLS1可能是通過改變細胞內谷氨酰胺的含量來調控細胞自噬。

6 剝奪谷氨酰胺對siRNA-GLS1 抑制的巨噬細胞內自噬流的影響

我們用mRFP-GFP-LC3 串聯熒光蛋白腺病毒感染巨噬細胞，隨后根據實驗需要進行處理，熒光顯微鏡觀察結果如圖6所示，在正常培養的RAW264.7細胞內，干擾GLS1后黃色和紅色LC3 陽性熒光斑點的數量顯著減少（P＜0.05）；剝奪谷氨酰胺處理RAW264.7 細胞后，敲減GLS1并沒有影響黃色和紅色的LC3 陽性熒光斑點數量。結合前面的結果，本研究認為，在BCG 感染巨噬細胞RAW264.7過程中，敲減GLS1后可通過增加巨噬細胞內的谷氨酰胺含量抑制BCG誘導的細胞自噬。

討 論

由于Mtb 感染持續時間較長，抗生素治療存在不良影響，以及耐多藥Mtb 的出現，目前可用于治療結核病的方法療效逐漸變差；同時由于新冠肺炎大流行的發生，醫療資源轉移，結核病的預防診斷和治療服務難度大幅增加［8-9］。因此，迫切需要發現新的靶點和開發新的策略和藥物來治療結核病。

巨噬細胞是宿主免疫防御的前哨，Mtb作為一種胞內寄生菌，感染巨噬細胞后會觸發一系列信號事件，為了自身利益而劫持宿主的先天免疫途徑，影響細胞凋亡、自噬和壞死等過程，其中自噬不僅可以維持細胞內穩態還可以清除入侵的病原菌［10-11］。本研究結果發現BCG 可以誘導巨噬細胞發生自噬，且存在時間依賴性。巨噬細胞免疫功能的執行并不是一個獨立的進程，其發生會受到代謝通路的影響。有研究表明，谷氨酰胺代謝在抵抗病原體的免疫應答中起著至關重要的作用，并且最新的報道顯示細胞谷氨酰胺代謝與針對結核分枝桿菌的有效宿主反應有關［4，10］。GLS1 是谷氨酰胺代謝的關鍵酶和限速酶。目前研究發現，Mtb 感染的骨髓巨噬細胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）和人巨噬細胞中GLS1 表達上調；另外，BCG 體外刺激人單核細胞后，參與谷氨酰胺代謝的氨酰胺酶和谷氨酸脫氫酶在單核細胞中也上調［12-13］。本研究發現，BCG感染巨噬細胞 RAW264.7 后，GLS1 表達也顯著上調，在 BCG 的MOI=10、感染時間為12 h 時表達量最高，與已報道的研究結果一致。我們還發現BCG 感染巨噬細胞后，細胞內谷氨酰胺含量顯著減少。有研究報道在Mtb感染BMDM 的早期（感染12 h），谷氨酰胺被迅速而廣泛地消耗［14］，與本研究結果一致。

Figure 2. The effect of BCG infection on glutamine catabolism in macrophages. A：the protein expression of GLS1 in RAW264.7 cells with different multiplicities of infection（MOI）of BCG was detected by Western blot；B：the protein expression of GLS1 in RAW264.7 cells with BCG infection for different time was detected by Western blot；C and D：the effect of BCG at different MOI for different time on intracellular glutamine content in RAW264.7 cells was detected by ELISA；E and F：the effect of BCG at different MOI for different time on intracellular glutamate content in RAW264.7 cells was detected by ELISA. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（Con）group.圖2 BCG感染對巨噬細胞內谷氨酰胺分解代謝的影響

Figure 3. Effect of GLS1 knockdown on glutamine content in BCG-infected macrophages. A：establishment of GLS1 knockdown model；B：ELISA detection of glutamine content. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC group；#P＜0.05 vs BCG group.圖3 敲減GLS1對BCG感染的巨噬細胞內谷氨酰胺含量的影響

Figure 4. Effect of GLS1 knockdown on BCG-induced macrophage autophagy. A：Western blot detection of LC3B，beclin-1 and ATG12 protein expression；B：flow cytometry detection of RAW264.7 cell autophagy rate. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs BCG group.圖4 敲減GLS1對BCG誘導的巨噬細胞自噬的影響

Figure 5. Effects of glutamine deprivation on expression of autophagy-related proteins in macrophages transfected with siRNA-GLS1.A：Western blot was used to detect the LC3B protein expression in RAW264.7 cells；B：rabbit anti-mouse LC3B antibody was used for immunofluorescence staining，and the nucleus was stained with DAPI（blue）for counterstaining（×400）；C：Western blot was used to detect the ATG5 and ATG12 protein expression. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group；#P＜0.05 vs BCG group.圖5 剝奪谷氨酰胺對siRNA-GLS1轉染的巨噬細胞內自噬相關蛋白表達的影響

Figure 6. Immunofluorescence observation of the effect of glutamine deprivation on autophagic flux in macrophages inhibited by siRNA-GLS1（×800）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs BCG group.圖6 免疫熒光觀測剝奪谷氨酰胺對siRNA-GLS1抑制的巨噬細胞內自噬流的影響

谷氨酰胺是最豐富的游離氨基酸之一，被認為是炎癥和許多其他應激條件下的必需氨基酸，口糧中添加L-谷氨酰胺可激活小鼠腸道固有免疫，增強疫苗免疫小鼠的免疫應答，減輕氧化應激［15-16］。Mortimore 等［17］的研究表明，氨基酸可以調節細胞自噬；Zhu等［18］的研究表明，谷氨酰胺代謝參與調控細胞自噬。GLS1 作為谷氨酰胺代謝的關鍵酶和限速酶，增加其表達可實現谷氨酰胺的高分解率。因此，細胞內谷氨酰胺含量會受到GLS1 表達量和活性的影響。本研究發現，敲減巨噬細胞內GLS1的表達顯著增加了細胞內谷氨酰胺的含量，并伴隨自噬的減弱，因此我們推測GLS1 調控的細胞自噬與細胞內谷氨酰胺含量增加相關。進一步驗證結果表明，在BCG 感染巨噬細胞RAW264.7 過程中，敲減GLS1的表達可通過增加巨噬細胞內谷氨酰胺含量而抑制細胞自噬。目前有研究發現，敲減GLS1后，細胞內谷氨酰胺分解代謝的確會受到影響，谷氨酰胺代謝物能夠產生谷胱甘肽和NADPH 來拮抗ROS，而ROS 又可以直接激活自噬，進而抑制細胞自噬［19］。另外，谷氨酰胺缺乏后，mTOR 的激活會減少，可通過抑制mTOR 來增強自噬［20］。

綜上所述，我們的研究初步探究了GLS1 在BCG感染的巨噬細胞自噬中的調控作用，但該過程的潛在分子機制仍需進一步深入研究。本研究為Mtb 致病機制的解讀提供新的視角與實驗依據。