基于熒光標記SSR基因分析技術的綠海龜人工繁育群體親緣關系鑒定

朱 鳴,葉明彬,謝子強,姜怡薇,廖寶林,陳華靈,肖寶華

(1.廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518000；2.深圳市碧海藍天海洋科技有限公司，廣東 深圳 518000；3.廣東惠東海龜國家級自然保護區管理局，廣東 惠州 516359)

0 引言

SSR(Simple sequence repeats)標記也稱為微衛星DNA(Microsatellite DNA)，是一類由幾個核苷酸為重復單元組成的簡單串聯重復序列，在生物尤其是高等生物的基因組中存在大量的該類序列[1]1047。SSR標記技術因為具有豐富的多態性、遵循孟德爾共顯性遺傳和易于從生物的基因組中進行擴增和檢測等優點，被廣泛用于遺傳圖譜的構建、目標基因的標定、指紋圖的繪制、品種鑒定、譜系分析、群體間遺傳距離分析、進化和遺傳多樣性等研究[2-4]。熒光標記SSR基因分析技術是在傳統的SSR標記技術上，利用熒光標記的引物在PCR擴增SSR基因位點時，使PCR產物的一條鏈帶上熒光標記[5]。該方法與傳統使用銀染的SSR標記技術相比，具有更高的檢測效率和更低的成本[6]。近年來，SSR分子標記技術被廣泛應用于家畜、家禽、水產經濟和一些珍稀瀕危物種的人工繁育種群親緣關系鑒定[1]1046,[7-10]。

綠海龜隸屬于海龜科(Cheloniidae)海龜屬(Chelonia)，是我國分布的5種海龜中種群數量最多的物種，也是我國一級保護動物[11-12]。由于受漁業捕獲、非法貿易、產卵地生境破壞和海洋污染等威脅，我國野生綠海龜種群資源在過去幾十年中嚴重衰退[13]。為了應對我國日益減少的綠海龜種群資源狀況，采用人工繁育科學技術手段進行擴繁、野化、放歸和種群復壯，成為綠海龜種群資源恢復的一條行之有效的途徑[14]。廣東省惠東海龜國家級自然保護區作為我國大陸唯一的海龜產卵場，在過去20年來開展了大量的綠海龜人工繁育技術研究[15]，并在國內首次全人工繁育出綠海龜子代[16]。在繁殖季，性成熟的雌性綠海龜在正常情況下可與多只公龜進行交配并產下幾十到上百個龜卵[17]。因此，在綠海龜人工繁育過程中，如何準確獲取子代海龜親緣關系信息成為人工選育及其遺傳譜系構建的難點。而基于微衛星的親緣關系鑒定技術的廣泛應用將有效地解決該問題。

目前，國內通過微衛星技術開展綠海龜親緣關系鑒定的研究仍未見相關報道。本研究基于熒光標記SSR基因分析技術，對廣東省惠東海龜國家級自然保護區人工繁育的2個子代綠海龜群體的遺傳多樣性和親緣關系進行研究，為建立相應的綠海龜人工繁育遺傳譜系以及開展綠海龜遺傳選育奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1 樣品采集

綠海龜組織樣品采自廣東省惠東海龜國家級自然保護區，綠海龜樣本為保護區2020年人工繁育的子代群體及其圈養的親本，其中包括G組子代群體26個樣本(編號G10～G35，為同一母龜子代)，H組子代群體26個樣本(編號H1～H26，為同一母龜子代)，2個確定的母本海龜樣品(編號X22、X34)和8個疑似父本綠海龜樣本(編號X1、X2、X10、X16、X40、X59、X74、X76)，共計62個樣本。采集樣品的綠海龜均為活體，剪取綠海龜前鰭少量上皮組織并保存在無水乙醇中，剪取完畢后用安多福溶液對剪取的傷口進行消毒。采集的樣品除了記錄編號以外，同時記錄相應取樣海龜的電子芯片號碼等其他相關信息。

1.2 基因組總DNA的提取

采用北京擎科生物科技有限公司生產的動物基因組DNA提取試劑盒(TSP201-200)提取綠海龜上皮組織樣品的DNA，所提取的DNA置于-20 ℃保存備用。

1.3 SSR引物初步篩選與設計合成

SSR引物位點來自Wang等[18]2013年在全球首次測序獲得的綠海龜全基因組草圖序列CheMyd_1.0(GenBank序列號：GCA_000344595.1)。利用MI-SA(Microsatellite identification tool)軟件根據全基因組草圖的轉錄組測序生物信息學分析得到SSR位點引物信息，根據SSR引物初步篩選原則篩選出適合擴增的不重復位點引物200對。200對引物合成時所有正向引物F的5′端加上通用Tag的16個堿基的引物序列進行修飾，在美國ABI公司生產的3730xl測序儀上進行2輪熒光PCR引物測序，得到的數據用Genemapper軟件進行分析，判斷不同引物是否具有片段多態性。

1.4 SSR-PCR篩選擴增及產物毛線管電泳檢測

隨機選取2個子代群體各8個綠海龜樣品的DNA，用合成的200對不同引物進行擴增，擴增體系(20 μL)各組分如下：上下游引物各1 μL,DNA模板1 μL，1.1×T3 Super PCR Mix(北京擎科生物科技有限公司) 16 μL。PCR擴增反應條件如下：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環，最后72 ℃延伸5 min。將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(2 μL樣品+6 μL溴酚藍)，300 V電壓下12 min，獲取鑒定膠圖，通過膠圖確定模板濃度，加水稀釋到毛細管電泳所需濃度。最后使用美國ABI公司生產的3730xl測序儀進行毛線管電泳檢測，獲取電泳檢測結果，篩選出多態性較好的位點。

1.5多態性位點分析篩選和群體擴增檢測

用軟件Gene mapper 4.1進行數據準確位點的分析，分析數據按照引物對應關系的核心堿基重復數片段大小來確定位點準確大小。根據分析出來的位點信息判斷檢測引物是否具有位點多態性，選取特異性高，多態性好的位點作為后續研究的重點(圖1)。最終篩選出20個多態性的位點，并將對應的20對引物合成熒光引物(表1)，對全部2個人工繁育子代群體和親本共62個樣品進行擴增并進行毛細管電泳檢測。

圖1 GST185位點的毛細管電泳峰圖

表1 20對微衛星引物的特征

1.6 多樣性和親緣關系鑒定分析

將每個個體的特異性條帶以條帶大小(bp)的方式統計，根據Gene mapper 4.1分析的峰圖，最終建立原始數據矩陣。在GenAlEx version 6.501和Cervus v.3.0軟件中，分別計算SSR位點和群體的各項遺傳多樣性指標，包括觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態性信息指數(PIC)、哈代溫伯格平衡(HWE)、無效等位基因頻率F(Null)。在Cervus v.3.0 的Allele frequency analysis程序中獲得各引物的基因頻率及非排除概率，再運行Simulation程序中的Maternity 子程序,輸入等位基因頻率文件，模擬10 000 次親子鑒定。

2 結果與分析

2.1 綠海龜人工繁育子代群體的遺傳多樣性分析

本研究篩選的20對微衛星引物對2個綠海龜人工繁育子代群體(G組和H組)的52個樣品進行遺傳多樣性分析(表2)，20個微衛星位點均呈多態性，共檢測出78個等位基因位點，每個位點的觀測等位基因數(Na)為2～8個，平均值為3.9；每個位點的有效等位基因數(Ne)為1.167～6.803個，平均值為2.726；20個微衛星位點的觀測雜合度(Ho)為0.019～0.808，平均值為0.508；期望雜合度(He)為0.145～0.861，平均值為0.555；多態性信息指數(PIC，用CPI表示)為0.135～0.835，平均值為0.494；20個微衛星位點的哈代溫伯格平衡檢測結果顯示，10個位點沒有偏離HWE平衡(P>0.05)，1個位點極顯著偏離HWE平衡(P<0.01)，2個位點極其顯著偏離HWE平衡(P<0.001)，7個位點未檢測到HWE平衡；除了GST024、GST040、GST105和GST108這4個位點外，其余位點的無效等位基因頻率F(Null)均小于0.1。

表2 20對SSR引物的多態性

2.2綠海龜人工繁育子代群體親緣關系鑒定分析

采用Cervus 軟件基于累積非親排除概率(Combined exclusion probability,CEP)來鑒定綠海龜人工繁育群體和疑似親本的親緣關系。王敏[19]研究指出，當累積非親排除概率大于或等于99.73%時， 認為存在親子關系；當累積非親排除概率介于95%～99%時，認為可能是親子關系；若累積非親排除概率小于或等于80%時，則認為不能確定是否存在親子關系。本研究加入2個確定母本和8個疑似父本綠海龜樣本進行親緣關系鑒定分析，其中候選母本為X22(確定的H組母本)和X34(確定的G組母本)，候選父本為X1、X2、X10、X16、X40、X59、X74、X76。用20對引物62個樣品進行分析，當雙親基因型未知時，累積排除概率(CE-1P)為0.999 339 851，大于99.73%；當單親基因型已知時，累積排除概率(CE-2P)為0.999 997 047，大于99.73%；當雙親基因型已知時，累積排除概率(CE-PP)為1，大于99.73%。2個綠海龜人工繁育子代群體(G組和H組)的52個樣品的親緣關系鑒定結果見表3。當可信度為95%時，母本鑒定率為75.00%，父本鑒定率為96.16%，雙親鑒定率為73.08%。G組人工繁育子代群體的母本為編號X34的綠海龜，父本全為編號X74的綠海龜；H組人工繁育子代群體的母本為編號X22的綠海龜，父本全為編號X2、X16和X76的綠海龜。

表3 2個綠海龜人工繁育子代群體親緣關系鑒定

表3 (續)

3 討論

群體遺傳多樣性分析是物種生物多樣性評估中的核心組成部分，也是評估生物資源現狀的重要指標[20]。本研究從觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態性信息指數(CPI)、哈代溫伯格平衡(HWE)等指標對2個人工繁育群體的遺傳多樣性情況進行分析。2個群體的20個微衛星位點平均等位基因數為3.9個，平均有效等位基因數為2.726個，平均觀測雜合度為0.508，平均期望雜合度為0.555，平均雜合度(Ho/He)為0.915。Botstein等[21]提出了有關生物多樣性評估標準，當CPI>0.50時的物種遺傳多樣性為高度多態性；0.25

目前，國內尚未有使用SSR分子標記技術開展海龜科生物親緣關系鑒定的報道。在國外，Ireland等[25]曾利用2個微衛星位點對南大西洋阿森松島3窩綠海龜子代的父本關系進行研究，發現這3窩子代海龜至少來自2個不同的父本海龜。本研究利用20個微衛星位點對2個已確定母本的人工繁育子代親緣關系進行分析，共從8個疑似親本中確定4個父本綠海龜。其中G組確定來源于同一只綠海龜父本，父本鑒定率為100%，母本鑒定率為65.38%；H組確定來源于3只不同的綠海龜父本，有2只子代海龜無法確定可靠父本，父本鑒定率為92.31%，母本鑒定率為88.46%。兩個子代的親緣關系結果顯示，父本鑒定率高于母本鑒定率。在綠海龜人工繁育過程中，通過母本產卵跟蹤標記的方式可以很準確地確定子代母本來源，但由于綠海龜交配時，雌性會與多只雄性進行交配，這對子代父本的確定增加了難度[26]。基于SSR位點分析的親緣關系鑒定技術，已在豬、馬、羊、牛等大型家畜、禽類和一些其他生物中開展過廣泛的應用，其可行性和準確率也得到了實踐的充分驗證[1]1046。本研究開發的20對綠海龜微衛星標記，其父本鑒定率均在90%以上，為綠海龜人工繁育群體進行準確親緣鑒定提供了重要的分子基礎數據。本研究的親緣鑒定方法也為國內在綠海龜遺傳譜系的構建和科學選育方面帶來了重要的理論基礎和實踐經驗。