泰國斗魚色氨酸羥化酶基因cDNA 克隆及其在雄魚好斗性中的作用

陳勇智，鄭銀娟，馬細蘭

(惠州學院 生命科學學院，廣東 惠州 516007)

0 引言

泰國斗魚(Bettasplendens)屬硬骨魚綱，鱸形目，攀鱸亞目，絲足鱸科，斗魚亞科，斗魚屬，其色彩鮮艷、體態多姿、容易飼養，備受觀賞魚愛好者的青睞。泰國斗魚雌雄個體差異顯著，雄性個體天生好斗，價格實惠，是研究魚類好斗性的極佳模型生物[1-3]。

好斗性作為一種數量性狀[4]，受多種基因的影響。目前發現與動物好斗性有關的分子通路有：5-羥色胺通路、多巴胺通路、組胺通路、下丘腦-垂體-腎間軸通路、下丘腦-神經垂體系統通路、下丘腦-垂體-性腺軸通路、一氧化氮通路、生長激素抑制素通路等[5]1145。5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)又稱血清素，由吲哚和乙胺組成，是一種單胺類神經遞質，在動物體的情緒調節、體溫調節、新陳代謝調節中起重要作用[6]，是5-羥色胺通路中的重要物質之一，其轉運體和受體是許多神經類藥物的作用靶點[7]。色氨酸羥化酶(Tryptophan hydroxylase，tph)又稱5-羥色胺合成酶，是色氨酸合成5-羥色胺過程中的重要催化酶[8]。5-羥色胺被證明與魚類的好斗性調控有十分密切的關系[9]499，其作用的通路中的色氨酸羥化酶基因tph在斑馬魚(Daniorerio)配對斗爭后，會在優勢個體的端腦中被激活[5]1142,[9]503，雄性斑馬魚在社群互動后，其5-羥色胺會在優勢個體的下丘腦中過度表達[5]1142,[9]503-504，這些都可能影響魚類的種群行為，幫助魚類形成社群等級。魚類好斗性的分子調控機制尚未完全清楚，有待進一步研究。

本研究利用RT-PCR方法，先從泰國斗魚腦組織中克隆并鑒定出色氨酸羥化酶基因(Tryptophan hydroxylase gene，tph)部分 cDNA片段，先通過配對斗爭法和鏡像斗爭法觀察記錄泰國雄性斗魚的打斗行為，然后通過熒光實時定量PCR技術比較斗爭前后個體或優勢、劣勢個體間tphmRNA的相對表達差異，為進一步闡明tph調控泰國斗魚好斗性的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用魚

雄性泰國斗魚，體長5～8 cm，從網上商城(深圳原始部落生態瓶商城和廣州藝仟寵商城)購買。

1.1.2 試劑

RNAiso Plus(總RNA試劑提取試劑盒)、Prime ScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(反轉錄試劑盒)、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0)(普通PCR試劑盒)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) (實時熒光定量PCR試劑盒)，均從寶生物工程(大連)有限公司購買。PCR引物則由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。

1.1.3 儀器設備

臺式冷凍離心機：德國Eppendorf Centrifuge 5418R；普通PCR擴增儀：GeneAmp PCR System 9700；熒光實時定量PCR儀：applied biosystems by life technologies,QuanStudio7 Flex；凝膠成像分析儀：Gel Doc XR；超低溫冰箱：中科美菱DW-HL388(-80 ℃)。

1.2 實驗方法

1.2.1引物的設計

在美國國家生物技術信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索與泰國斗魚親緣關系較近魚類的tphcDNA序列。用Clustal X軟件對尼羅羅非魚 (Oreochromisniloticus)、軍曹魚(Rachycentroncanadum)、尖齒胡鯰(Clariasgariepinus)等魚類的tph進行同源序列比對，根據保守序列，設計用于泰國斗魚tph克隆的簡并引物，并根據測序結果設計用于實時定量表達分析的特異性引物，另外，查閱文獻得到泰國斗魚管家基因β-actin的特異性引物[10-11](表1)。

表1 PCR擴增引物序列

1.2.2總RNA的提取

本研究采用Trizol法提取總RNA。用高溫滅菌的剪刀、鑷子取出泰國斗魚全腦，放入裝有1 mL Trizol溶液的1.5 mL離心管，用一次性注射器(1 mL)將組織抽打均勻；室溫(15～30 ℃)放置5 min，加入0.2 mL氯仿，用力震蕩30 s；室溫放置5 min，4 ℃，12 000 r·m-1，離心15 min，吸取400 mL上清液到另一新的1.5 mL離心管，加入0.4 mL異丙醇，上下輕柔顛倒離心管數次，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 r·m-1，離心10 min，底部出現少量RNA白色沉淀；小心倒掉上清液，加入75%乙醇1 mL，清洗沉淀，共洗滌2次；棄上清，打開管蓋，室溫晾干沉淀后，加入10～20 μL去RNA酶水以溶解RNA沉淀；用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，并放入-70 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.3 cDNA的合成

因真核生物mRNA 3′末端存在Poly(A)尾巴，故用Olig dT作為引物，用逆轉錄酶將mRNA逆轉錄成與之互補的cDNA。逆轉錄試劑盒為Prime ScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，具體操作見說明書。獲得cDNA后，用內參基因β-actin引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，若PCR產物條帶單一且清晰明亮則可判斷cDNA質量良好，可用于下一步的實驗。

1.2.4tph中間片段的克隆及特異性引物的設計

以質量良好的cDNA為模板，用表1中簡并性引物(tph-F和tph-R)進行擴增tphcDNA片段；再將符合預計片段大小的產物送華大基因公司測序，得到tph基因部分核苷酸序列；然后用軟件Primer Primer 5.0設計出特異性引物，用于后續熒光實時定量PCR分析。

1.2.5配對斗爭和鏡像斗爭行為學觀察

配對斗爭法：將兩條雄魚放入同一實驗裝置中，觀察記錄其打斗行為，并依據最后的斗爭結果，分為優勢個體(D)和劣勢個體(I)。鏡像斗爭法：在實驗裝置中以約22.5°角傾斜放入一面鏡子，觀察記錄該雄魚與鏡像的“打斗”行為。

實驗設計如下：選取體型、規格相近的雄性泰國斗魚13尾，設置未斗爭實驗組(B)、配對斗爭實驗組(F)、鏡像斗爭實驗組(M)，其中配對斗爭實驗組(F)和鏡像斗爭實驗組(M)都屬于斗爭后實驗組(A)，每一個未斗爭實驗組(B)需1尾雄性斗魚，每一個配對斗爭實驗組(F)需2尾雄性斗魚，每一個鏡像斗爭實驗組(M)需1尾雄性斗魚。每組處理均做3次平行。另需1尾未做任何處理的雄性斗魚B0作為定量分析的校正，故共需13尾雄性泰國斗魚(表2)。

表2 雄性泰國斗魚校正組及實驗組的平行樣編號表

校正組和未斗爭實驗組泰國斗魚不進行任何處理，直接采集斗魚全腦，提取總RNA。配對斗爭實驗組優勢個體記為D，劣勢個體記為I，共進行3次實驗得出3個實驗組D1、I1，D2、I2，D3、I3，每一實驗組斗爭結束后迅速采集斗魚全腦，提取總RNA。鏡像斗爭實驗組則選取1尾雄性斗魚放入透明實驗器皿中，以約22.5°角在其內放置一面鏡子，觀察泰國斗魚的好斗行為(包括魚鰭的豎立、身體的起伏抖動及撕咬器皿壁等)，共進行3次實驗得到M1、M2、M3， 15 min后迅速采集全腦，提取總RNA。所有總RNA反轉錄生成cDNA模板待用。

1.2.6 熒光實時定量PCR檢測tphmRNA表達

先以校正組B0的cDNA產物為模板，以特異性引物對(qtph-F和qtph-R、qβ-actin-F和qβ-actin-R)進行實時定量PCR，采用相對定量法得到各組tph的相對表達量。

實時定量PCR程序設定如下，預熱階段 ：95 ℃，1 min；PCR 階段:95 ℃，15 s，65 ℃，35 s，40個循環；溶解曲線階段：95 ℃，15 s，65 ℃，35 s，95 ℃，10 s。

1.2.7 數據分析

本研究采用2-△△Ct法對數據進行分析，利用對照樣、待檢樣內參基因(β-actin)及目的基因(tph)的循環閾值(cycle threshold，Ct)，以內參基因的Ct值為內源性控制對目的基因進行校正，求得待測樣的相對表達量(relative quantity，QR)。將QR值輸入SPSS 17.0軟件進行ANOVA方差分析及多重比對。

2結果與分析

2.1 泰國斗魚tph的cDNA克隆

2.1.1 總RNA的提取及cDNA合成

用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測各樣品總RNA的質量，選取質量良好的總RNA為模板，進行下一步逆轉錄實驗得到cDNA，以cDNA為模板、β-actin為引物進行PCR擴增，然后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，每份cDNA都擴出單一、清晰的β-actin條帶，表明cDNA質量良好(圖1)。

2.1.2tph中間片段的擴增

以校正組B0的cDNA產物為模板，tph-F和tph-R簡并引物擴增tph的cDNA，然后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，在281 bp左右出現預期條帶(圖2)。

圖2 tph基因PCR產物電泳圖

2.1.3tph部分片段測序結果

將tph的PCR產物與引物送檢測序，得到253 bp的核苷酸序列，結果如下：AAAGGGGGAGCTTCGAGCGTATGGAGCAGGACTGCTGTCCTCCATCAGTGAGCTTAAGCACGCACTCTCTGGTAATGCAAGGATAATGCCCTTTACCCCAAAGTTACATCCAAACAAGAATGCATCATCACAACCTTCCAGGATGTTTACTTTGTGTCAGACAGCTTTGAGGAGGCCAAAGTCAAGATGAGGGAGTTTGCCAAGACTATCAAGCGCCCCTTCACAGTGCGATACAACCCCTACACCCAGAGA。

將以上得到的核苷酸序列運用NCNI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Nucleotide BLAST程序進行同源性比對，其與已知的軍曹魚、黃鱔(Monopterusalbus)、大黃魚(Larimichthyscrocea)、黃金鱸(Percaflavescens)、高體鰤(Serioladumerili)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、大刺鰍(Mastacembelusarmatus)、黃條鰤(Seriolalalandi)、尖吻鱸(Latescalcarifer)、南極鱈(Nototheniacoriiceps)、印度玻璃魚(Parambassisranga)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、深裂眶鋸雀鯛(Stegastespartitus)的tph的同源性分別為94%、93.55%、93.15%、93.44%、92.74%、92.40%、92.34%、92.34%、92.34%、92.34%、92.00%、91.94%、91.94%，均高于90%，比對覆蓋率均大于98%。由此可判斷克隆得到的cDNA為泰國斗魚tph的部分序列。

2.2 泰國斗魚tph的序列分析

2.2.1 氨基酸序列分析

將測序所得的核苷酸序列輸入DNAStar7.1軟件Editseq程序中，通過手動尋找開放閱讀框ORF，分析得到84個氨基酸序列，結果如下：KGELRAYGAGLLSSISELKHALSGNARIMPFDPKVTSKQE CIITTFQDVYFVSDSFEEAKVKMREFAKTIKRPFTVRYNPYTQR。與其他已知部分魚類的tph氨基酸序列進行同源性分析，結果表明泰國斗魚tph的氨基酸序列與軍曹魚、黃鱔、大黃魚、黃金鱸、高體鰤、半滑舌鰨、黃條鰤、尖吻鱸的同源性均為97.59%，與大刺鰍、牙鲆、深裂眶鋸雀鯛的同源性為96.39%，說明魚類tph具有高度的同源性。

2.2.2 進化樹分析

從NCBI上查找其他魚類及一些哺乳綱、爬行綱有代表性物種的tph核苷酸序列，與本試驗得到的泰國斗魚tph核苷酸序列進行同源性序列比對，用MEGA 7軟件轉換成MEGA 7所能識別的格式(.txt)，用MEGA 7軟件鄰接比鄰算法(Neighbor-joining)建立系統進化樹(圖3)。從系統進化樹可以看出，泰國斗魚與軍曹魚、大黃魚等同屬于鱸形目，在進化樹上，屬于一大支，而與鮭形目的虹鱒(Oncorhynchusmykisss)，鯉形目的斑馬魚的遺傳距離相對較遠，與海七鰓鰻(Petromyzonmarinus)、小鼠(Musmusculus)、家兔(Oryctolaguscuniculus)、智人(Homosapiens)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的遺傳距離逐漸增大。

節點的數值為NJ分析的Bootstrap置信度(1 000次重復)。圖3 基于tph核苷酸序列建立的泰國斗魚與其他物種的系統進化樹

2.3 斗爭行為學觀察

2.3.1配對斗爭

把2尾雄魚同時放入一個透明燒杯后，兩者立即進入戰斗狀態，A魚突然發出抖動行為，使對面正在靠近的B魚改變游動方向，抑或是A魚猛然突擊不遠處的B魚，使其逃避后返回原地；接著是互相盤旋，并開始試圖撕咬對方。隨著戰斗的加強，斗爭行為表現為：頻繁地撕咬，撕咬部位通常為臀鰭和尾鰭；用身體或尾鰭攻擊對手；最后優勢個體表現出追擊行為，而劣勢個體則表現出順從、靜止和逃跑行為。

2.3.2 鏡像斗爭

當把鏡子放入有1尾雄魚透明燒杯后，斗魚立即表現出好斗性行為：鰓張開，鰭條豎立和身體抖動及起伏等，好斗性強的個體更表現在用尾部撞擊鏡像，張嘴撕咬鏡像等斗爭行為。

2.4斗爭前后tph的mRNA表達分析

運用熒光實時定量PCR技術對斗爭前、后或斗爭后優、劣勢個體間tph基因的mRNA表達差異進行比較。實驗分為5個組：校對組(B0)，斗爭前組(B)，配對斗爭組(包括優勢個體組D及劣勢個體組I)和鏡像斗爭組(M)，B組、D組、I組、M組分別包含3個平行。

2.4.1 特異性引物的設計與檢測

將測序結果輸入Primer Primer 5.0軟件設計出各項評分最高的特異性引物：qtph-F、qtph-R，該引物的溶解曲線顯示為單峰，說明PCR產物專一，引物特異性強，可用于定量表達分析。

2.4.2 各組tph相對表達分析

以校對組B0為對照樣品，其tphmRNA表達值設為1，對其余樣品的相對表達值QR進行方差分析，結果如表3所示。

表3 tph基因的相對表達量(n=3)

方差分析表明：D、I、M組與B組均差異顯著(P<0.05)；其中D、I組與B組差異達到極顯著水平(P<0.01)；D組與I 組差異也達到極顯著水平(P<0.01)(表3)。以上分析表明，無論是配對斗爭法還是鏡像斗爭法，斗爭后個體tphmRNA表達量都明顯高于未斗爭個體；配對斗爭中，優勢個體D的表達量極顯著高于劣勢個體I，也極顯著高于鏡像斗爭后個體M。

3討論

本文通過RT-PCR技術，克隆得到了泰國斗魚tph的部分核苷酸序列，片段長為253 bp。通過BLAST核苷酸序列同源分析，泰國斗魚的tph核苷酸序列與已知軍曹魚、黃鱔、大黃魚、黃金鱸、高體鰤等多種魚類tph的同源性都達90%以上，據此可判斷本次克隆得到的cDNA為泰國斗魚tph的部分序列。根據BLAST氨基酸序列比對的結果，泰國斗魚tph的氨基酸序列與軍曹魚、黃鱔、大黃魚、黃金鱸、高體鰤等魚類的同源性更是高達96%以上，表明魚類tph具有高度的同源性。從系統進化樹可以看出，泰國斗魚在遺傳進化上與同屬于鱸形目的魚類親緣關系較近，而與屬于鮭形目的虹鱒、屬于鯉形目的斑馬魚的遺傳距離相對較遠。

有研究表明雄性斑馬魚經配對斗爭后，5-羥色胺通路在優勢個體的端腦中被激活，在劣勢個體的視頂蓋中被激活[5]1142，[12]；雄性斑馬魚經社群互作后，優勢個體下丘腦中的tph過度表達[5]1142,[9]503-504。本研究結果與上述斑馬魚的好斗性研究結果相似，雄性泰國斗魚無論是用配對斗爭法還是鏡像斗爭法，斗爭后個體tphmRNA表達量均明顯高于未斗爭個體(P<0.05)；配對斗爭中，優勢個體D的表達量極顯著高于劣勢個體I(P<0.01)，也極顯著高于鏡像斗爭后個體M(P<0.01)，即當泰國斗魚進入戰斗模式后，其tph表達上調；斗性越強的雄性泰國斗魚即優勢個體的tph表達量越高，由此說明tph與雄性泰國斗魚的好斗性呈明顯的正相關，說明色氨酸羥化酶基因tph表達確實參與了泰國斗魚好斗性的調控，但具體的分子調控機制還有待進一步深入研究。