金葡素SEC2改構(gòu)蛋白2M-118對AOM-DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌的干預(yù)作用

王義山，李洪義，王雨純，潘 夢;3b，張曉鑫，鐘小剛，曾海洋，溫志騰，宋 宇

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 a.熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.海南熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.水產(chǎn)與生命學(xué)院， 海南 三亞 572022；2.沈陽協(xié)合生物制藥股份有限公司，沈陽 110179；3.吉林大學(xué) a.動物科學(xué)學(xué)院；b.生命科學(xué)學(xué)院，長春 130062)

0 引言

結(jié)腸癌(Colorectal cancer,CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在世界癌癥死亡率中排名第三位，是一種十分難以治愈的消化道疾病[1-2]。研究表明，患有炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)或潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)的群體與未患相關(guān)腸道疾病的群體相比，更加容易患結(jié)腸癌，并且其患病概率與前期腸道疾病的持續(xù)時間和嚴(yán)重程度成正比。常規(guī)的化療、放療手段在殺傷癌細(xì)胞的同時，不可避免地對正常細(xì)胞造成不可恢復(fù)的損傷，導(dǎo)致患者生存率較低[3-6]。金葡素C(Staphylococcal enterotoxins C,SEC)是由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的外源性超抗原，從葡萄球菌腸毒素中分離而來，它具有強(qiáng)大的T細(xì)胞活化能力。經(jīng)檢測，SEC通過產(chǎn)生多種細(xì)胞因子參與身體免疫應(yīng)答[7]。SEC的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)主要來自金葡素注射液治療，其主要活性成分為SEC2，在中國用于臨床癌癥治療已超過20年。研究表明，金葡素注射液治療可顯著增加與抗腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞數(shù)量，改善局部免疫反應(yīng)[8]，但SEC作為一種天然腸毒素，具有一定的免疫毒性，可導(dǎo)致發(fā)熱、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)[9]，因此需要對其蛋白突變體進(jìn)行深入研究。2M-118是SEC2在其氨基酸序列的第20、22和118位氨基酸殘基進(jìn)行突變而得到的新型突變體，其毒性作用較低，具有良好的抗腫瘤療效[10]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，SEC對AOM-DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸癌有一定的改善作用。本研究進(jìn)一步探索其改構(gòu)蛋白2M-118對結(jié)腸癌的藥效學(xué)作用，以期為揭示改構(gòu)蛋白2M-118的相關(guān)藥理作用及機(jī)制提供新思路及新的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

45只無特定病原體(Specefic pathogen free)SPF級C57BL/6雄性小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司(5周齡，體質(zhì)量為17～19 g)，動物許可證號：SCXK(蘇)2018-0008。在吉林大學(xué)動物倫理福利委員會監(jiān)督下，本研究在吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心屏障設(shè)施內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)，并遵守吉林大學(xué)及國家對于實(shí)驗(yàn)動物倫理福利的要求。實(shí)驗(yàn)過程中允許小鼠自由采食飲水。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

超抗原SEC改構(gòu)蛋白2M-118由沈陽協(xié)合生物制藥股份有限公司提供；氧化偶氮甲烷(Azoxymethan,AOM)購自美國Sigma公司；葡聚糖硫酸鈉(Dextran sodium sulfate,DSS)購自瑞典TdB公司；細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒購自美國Biolegend生物技術(shù)有限公司；蘇木素-伊紅染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器

小型動物氣體麻醉機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；石蠟包埋機(jī)，石蠟切片機(jī)(Thermo Fisher Scientific)；全波長酶標(biāo)儀(Biotek)；組織勻漿機(jī)(M.P.Biomedicals)。

1.4 結(jié)腸癌模型建立與給藥方法

小鼠自購入后于SPF實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施中適應(yīng)飼養(yǎng)一周，而后將小鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常對照組(CTL)，AOM-DSS模型組(CRC)和2M-118腹腔注射給藥(2M-118)組，每組10只。CRC組和2M-118組小鼠腹腔注射AOM 10 mg·kg-1，CTL組小鼠腹腔注射生理鹽水10 mL·kg-1。恢復(fù)7 d后，CRC組和2M-118組改用2.5%DSS飲用7 d，恢復(fù)14 d，以21 d為DSS周期。結(jié)腸癌模型的建立需要3個DSS周期，然后正常喂養(yǎng)直至腫瘤成熟，每日記錄小鼠體質(zhì)量。2M-118組給藥從第二個DSS周期的第7天開始，每3天按2.5 mg·kg-1體質(zhì)量腹腔注射一次；正常組和模型組注射等量生理鹽水，3組給藥同時進(jìn)行，給藥7次后停藥1個月，再重復(fù)給藥方案，反復(fù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.5 體質(zhì)量變化率、免疫器官指數(shù)及抑瘤率計算

實(shí)驗(yàn)前后稱小鼠體質(zhì)量，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各組小鼠脾臟及腫瘤稱量，按公式(1)～公式(3)分別計算體質(zhì)量變化率w(%)、脾臟指數(shù)n及抑瘤率η(%)。

(1)

(2)

(3)

其中：m1為小鼠第一天體質(zhì)量(g)，mi為小鼠第i天體質(zhì)量(g)；ms為脾臟質(zhì)量(mg)，mr為小鼠體質(zhì)量(g)；mc為模型組平均瘤質(zhì)量(g)，mt為給藥組平均瘤質(zhì)量(g)。

1.6 病理切片

將結(jié)腸組織保存于10%甲醛溶液中固定。實(shí)驗(yàn)時取出組織適當(dāng)修剪，置于包埋盒中，用70%乙醇浸泡3次，每次30 min，在第三次的乙醇中浸泡過夜。第二天分別用80%、90%、95%乙醇和無水乙醇梯度脫水30、40及50 min。取出脫水后的組織置于無水乙醇與二甲苯體積比為1 ∶1的溶液中浸泡1 h，然后用二甲苯浸泡2次，每次7 min。取出組織，置于二甲苯和熔點(diǎn)54～56 ℃的軟蠟1 ∶1混合液中50 min。取出組織，置于熔點(diǎn)54～56 ℃的軟蠟中浸泡。取出組織，置于熔點(diǎn)58～60 ℃的硬蠟中浸泡。取出組織，在石蠟包埋機(jī)中進(jìn)行包埋，得到蠟塊后4 ℃冷藏過夜。第二天進(jìn)行切片染色，使用中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察拍照。

1.7 ELISA檢測

取保存于-80 ℃冰箱的結(jié)腸組織，提取蛋白，定量蛋白濃度后，按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-17及IFN-γ的表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，采用Graphpad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；組間差異用One-way ANOVA比較，*/#P<0.05為有顯著性差異，**/##P<0.01為差異性極顯著。

2 結(jié)果

2.1 2M-118對結(jié)腸癌小鼠體質(zhì)量變化的影響

實(shí)驗(yàn)期間每3天記錄一次小鼠體質(zhì)量，每組小鼠平均體質(zhì)量的變化情況見圖1。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，正常組小鼠體質(zhì)量變化率有些許波動，但總體比較平穩(wěn)；模型組小鼠體質(zhì)量在注射AOM隔天急劇下降，后緩慢回升，在DSS I期結(jié)束時體質(zhì)量持續(xù)下降，第二次DSS飲水后體質(zhì)量下降到最低；2M-118干預(yù)組的體質(zhì)量變化趨勢在給藥前與模型組基本一致，給藥后體質(zhì)量變化率趨于平穩(wěn)，體質(zhì)量下降率明顯低于模型組，這種差異在DSS Ⅲ期表現(xiàn)更為明顯。

時間/d圖1 小鼠體質(zhì)量變化率

2.2 2M-118對結(jié)腸癌小鼠免疫器官指數(shù)及抑瘤率的影響

各組小鼠脾臟指數(shù)和抑瘤率計算結(jié)果如表1所示。與正常組CTL相比，模型組CRC的脾臟指數(shù)無明顯升高，但呈現(xiàn)升高趨勢；2M-118組的脾臟指數(shù)與正常組及模型組相比均有顯著升高，且平均瘤質(zhì)量明顯低于模型組，計算得2M-118組的抑瘤率為60.45%。

表1 小鼠脾臟指數(shù)及抑瘤率的比較

2.3 小鼠結(jié)腸癌情況評估

在實(shí)驗(yàn)期間，每天收集小鼠糞便，綜合小鼠糞便性狀及體質(zhì)量變化率(w)進(jìn)行疾病活躍指數(shù)(Disease activity index)DAI評分，共3個評分項(xiàng)，每項(xiàng)滿分4分，3項(xiàng)得分總和即為DAI得分，總分越高說明小鼠患病情況越嚴(yán)重，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 小鼠的DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)表2統(tǒng)計所得小鼠DAI評分變化情況如圖2所示。在整個實(shí)驗(yàn)周期中，正常組小鼠的DAI評分由于體質(zhì)量變化率的變化而略有波動，總體評分為0分，說明小鼠未患病；模型組小鼠評分在DSS Ⅱ期和Ⅲ期飲水過程中達(dá)到峰值，即患病情況最嚴(yán)重，與體質(zhì)量變化基本保持一致；2M-118組DAI評分達(dá)到峰值的時間與模型組基本保持一致，分?jǐn)?shù)略高于模型組，但在飲水結(jié)束后的恢復(fù)期內(nèi)，2M-118組的評分明顯低于模型組。綜上所述，2M-118對結(jié)腸癌小鼠有一定的治療作用。

時間/d圖2 小鼠的DAI評分

2.4 2M-118對結(jié)腸癌小鼠病理變化的影響

取各組小鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色制成切片，在顯微鏡下觀察腸道病理變化情況。如圖3(a)所示，正常組小鼠結(jié)腸肌層和黏膜層形態(tài)完整，且隱窩排列整齊，無病變情況。圖3(b)中模型組小鼠的結(jié)腸內(nèi)壁呈菜花狀突起，腫瘤向下浸潤至黏膜層，腺體增生活躍，有背靠背及共壁現(xiàn)象，造成局部結(jié)構(gòu)不清晰，腫瘤位置的肌層出現(xiàn)纖維化的情況，并且明顯增厚，腫瘤惡性程度較高。如圖3(c)所示，2M-118組小鼠結(jié)腸組織有部分炎癥細(xì)胞浸潤，但黏膜層基本完整，隱窩輕度擴(kuò)張，但仍可見完整的隱窩腔，肌層輕度增厚，腫瘤惡性程度明顯低于模型組。上述結(jié)果說明，2M-118在一定程度上可以改善小鼠結(jié)腸癌。

(a)正常組(CTL) (b)模型組(CRC) (c)給藥組(2M-118)圖 3 小鼠結(jié)腸組織病理切片(50×)

2.5 2M-118對小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后提取小鼠結(jié)腸組織蛋白，采用ELISA法檢測各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-17和IFN- γ的分泌情況，結(jié)果如圖4所示。與正常組相比，經(jīng)AOM-DSS誘導(dǎo)造模的模型組小鼠結(jié)腸組織中的4個細(xì)胞因子的表達(dá)均顯著升高。如圖4(a)及圖4(b)所示，與模型組相比，2M-118組的小鼠結(jié)腸癌組織中TNF-α及IL-6這兩種炎癥因子的表達(dá)均被顯著的下調(diào)，炎癥因子IL-17的表達(dá)也有下降的趨勢[圖4(c)]；而IFN-γ的表達(dá)與模型組并未產(chǎn)生顯著性差異，但與正常組有極顯著性差異[圖4(d)]。上述結(jié)果表明，2M-118不僅能夠通過抑制結(jié)腸癌發(fā)展過程中某些相關(guān)炎癥性細(xì)胞因子的分泌以改善小鼠結(jié)腸癌，也可能通過提高機(jī)體自身免疫這一途徑達(dá)到抑制腫瘤的效果。

與CRC組相比，*P<0.05，** P <0.01；與CTL組相比，#P <0.05，##P<0.01，###P<0.001。圖 4 小鼠結(jié)腸因子表達(dá)量

3 討論

結(jié)腸癌通常由長期的慢性炎性腸病發(fā)展而來，慢性腸病如不能及時得到恢復(fù)、治療，將會大大增加癌變概率。然而，結(jié)腸癌的治療方法極其有限，當(dāng)進(jìn)行治療時，很難避免對正常細(xì)胞造成損傷，使患者長期承受患病帶來的巨大痛苦。因此需要從機(jī)體天然免疫方面尋求突破，如何激發(fā)機(jī)體自身免疫對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的殺傷與抑制作用是治療結(jié)腸癌的熱點(diǎn)之一[11]。有研究表明，超抗原對機(jī)體免疫細(xì)胞具有強(qiáng)烈的激活作用，并且在臨床上已有輔助放療、化療，改善癌癥患者生活質(zhì)量的應(yīng)用[12-14]。

本研究采用AOM-DSS誘導(dǎo)發(fā)生的結(jié)腸癌小鼠模型，并通過腹腔注射2M-118進(jìn)行干預(yù)，以探究2M-118對結(jié)腸癌的作用情況。以這種方式誘發(fā)的結(jié)腸癌是與結(jié)腸炎相關(guān)的癌癥，類似于人類由長期慢性腸道炎癥形成的結(jié)腸癌[15]。病理切片的結(jié)果顯示，2M-118對腸道黏膜有一定的保護(hù)作用，能減輕炎癥并降低隱窩細(xì)胞的損傷程度，從而改善腫瘤的惡性程度。結(jié)腸癌的發(fā)展過程由諸多因素共同調(diào)控，主要與免疫應(yīng)答和促炎、抗炎細(xì)胞因子的分泌有關(guān)[16]。在腸道損傷和修復(fù)過程中，細(xì)胞因子主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生，主要包括IL-6、IL-17和TNF-α、IFN-γ等等。這些細(xì)胞因子通過控制細(xì)胞的增殖和凋亡，調(diào)控血管的生成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[17-22]。NF-κB-IL-6-STAT3通路是炎癥因子表達(dá)的核心通路[23]，對結(jié)腸癌的發(fā)生有重要影響，編碼IL-6的基因受到NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，活化的NF-κB提高IL-6的表達(dá)，進(jìn)而影響STAT3，促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的生長[24-25]。而本研究中，2M-118顯著降低了小鼠結(jié)腸組織中促炎因子IL-6的表達(dá)。因此我們推測，這可能與NF-κB-IL-6-STAT3通路中下游STAT3被抑制有關(guān)，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。有研究已明確，超抗原的作用機(jī)制為SE依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用(SE dependent cell mediated cycotoxity，SDCC)[26]，SE激活的CD4+T細(xì)胞能分泌足夠的細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、TNF-γ、IL-2、IL-6、IL-12等。這些細(xì)胞因子可以進(jìn)一步激活NK細(xì)胞發(fā)揮自然殺傷作用。而IFN-γ、TNF還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞MHCⅡ類分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)SE的抗腫瘤作用[27]。在本研究中，2M-118僅有下調(diào)IFN-γ分泌的趨勢，結(jié)果與模型組相比并無顯著差異，但與正常組存在極顯著差異。因此，我們推測2M-118可能促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，激活NK細(xì)胞的自然殺傷作用，通過增強(qiáng)SDCC以達(dá)到抑制腫瘤的效果。這一推測是否正確需要進(jìn)一步加以驗(yàn)證。腫瘤壞死因子一方面能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，使腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面也能作為炎癥因子介導(dǎo)炎癥的發(fā)生，其中TNF-α主要由巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞產(chǎn)生[28-29]。有研究表明，TNF-α可以通過維持腸道干細(xì)胞的存活，刺激腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致晚期CRC患者腫瘤的浸潤與擴(kuò)散[30]。在本研究中，2M-118顯著下調(diào)了結(jié)腸組織內(nèi)TNF-α的表達(dá)，且表達(dá)量遠(yuǎn)低于模型組，并與正常組無明顯差異，但本實(shí)驗(yàn)并未檢測脾臟、淋巴等免疫器官中細(xì)胞因子的表達(dá)量。因此，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果僅能證明2M-118能夠抑制TNF-α的促炎作用，尚不明確其是否通過參與SDCC途徑以改善結(jié)腸腫瘤癥狀，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

本研究通過建立AOM-DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌模型，初步探究2M-118對潰瘍性結(jié)腸癌的藥效學(xué)作用及作用機(jī)制。2M-118能夠抑制促炎因子TNF-α、IL-6和IL-17的表達(dá)，并可能促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)免疫改善結(jié)腸癌。本研究明確了2M-118對AOM-DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌具有顯著的改善作用，為2M-118抗小鼠結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，為結(jié)腸癌的治療提供了一種新的治療藥物。