健康從業人員中產ESBLs鼠傷寒沙門氏菌的研究

尹建雯，賈森泉，周永明，古文鵬，趙智嫻

(云南省疾病預防控制中心 急性傳染病防制所，云南 昆明 650022)

沙門氏菌是全球范圍內報道最多，各國公認的食源性疾病所致感染性腹瀉的首要致病菌[1]，血清型種類繁多，其中鼠傷寒沙門氏菌屬于常見血清型之一，廣泛存在于自然環境和人類食物飲用水中，可引起食物中毒，造成不同程度腸炎疾病[2，3]，是引起食源性疾病暴發的優勢血清型。抗生素的使用對細菌感染起到良好的治療作用，但是也導致大量耐藥菌株，甚至是多重耐藥包括碳青霉烯酶耐藥、超廣譜β-內酰胺酶(Extended-Spectrum β-lactamase，ESBLs)耐藥，使得抗生素的使用范圍越來越窄。鼠傷寒沙門氏菌的臨床耐藥情況不容忽視[4]。本研究從健康服務從業人員的肛拭標本中分離出的鼠傷寒沙門氏菌中篩選出ESBLs的菌株，再進行耐藥分析及脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析，了解鼠傷寒沙門菌的耐藥情況，為鼠傷寒沙門氏菌的監測提供參考。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

挑選2016—2018年某區健康服務從業人員體檢肛拭標本，共60533份(其中2016年15321份。2017年17618份，2018年27594份，共檢出鼠傷寒沙門氏菌68株，其中產ESBLs的6株。

1.1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)儀、PFGE、凝膠成像儀。

磺胺增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、三糖鐵瓊脂，全自動生化革蘭氏陰性菌[(Gram-negative，GN)鑒定卡(簡稱GN卡)]、沙門菌診斷血清、ESBLs選擇培養基、沙門氏菌診斷血清、限制性內切酶XbaⅠ(TAKARA)、蛋白酶K(Merck)、Seakem Gold Agarose(LONZA)、Tris-Hcl(SolarBio)、EDTA(SolarBio)、TBE(SolarBio)、Gelred(biotium)，PCR Mix(TAKARA)、瓊脂糖(Bio-Rad)、DNA Marker2000(TAKARA)、革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測板，均在有效期內使用。抗生素藥敏檢測板包括：氨芐青霉素(Ampicillin，AMP)、氨芐西林-舒巴坦(Ampicillin Sodium and Sulbactam Sodium，AMS)、四環素(Tetracyclines，TET)、氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、復方新諾明(Sulfamethoxazole，SMZ)、頭孢唑林(Cefazolin，CFZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime，CTX)、頭孢他啶(Cazpentahydrate，CAZ)、頭孢西丁(Cefoxitin，CFX)、慶大霉素(Gentamycin，GEN)、亞胺培南(Imipenem，IMI)、萘啶酸(Nalidixic Acid，NAL)、阿奇霉素(Azithromycin，AZI)、磺胺異噁唑(Sulfisoxazole，Sul)、環丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、阿莫西林-克拉維酸(Amoxicillin and Clavulanate，AMC)、頭孢噻肟-克拉維酸(CefotaximeSodiumsalt-Claforan，CTX-C)、頭孢他啶-克拉維酸(Cazpentahydrate-Claforan，CAZ-C)、多黏菌素B(Polymyxin B，PB)、多黏菌素E(Colistin，CT)、米諾環素(Minocycline，MIN)、阿米卡星(Amiklin，AMI)、氨曲南(Aztreonam，AZM)、美羅培南(Meropenem，MEM)、頭孢吡肟(Cefepime，CAS)、左氧氟沙星(Levofloxacin，LEV)、多西環素(Doxycycline，DOX)、卡那霉素(Kanamycin，KAN)、鏈霉素(Streptomycin，STR)、吉米沙星(Gemifloxacin，GEM)。PCR引物為某公司合成，引物序列見表1。

表1 耐藥基因引物序列及目的片段、退火溫度

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離鑒定

參照GB/T 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[5]和WS 280-2008《傷寒和副傷寒診斷標準》[6]進行沙門菌檢驗。從業人員肛拭標本用SBG肉湯36 ℃增菌18～24 h；取增菌液分別劃線至XLD，36 ℃培養18～24 h，挑取可疑菌落轉種于三糖鐵斜面，36 ℃培養18～24 h，生化符合的進行全自動細菌生化系統鑒定，鑒定卡為GN卡。經生化鑒定為沙門菌的進行血清分型鑒定。典型鼠傷寒沙門菌血清型為1，4，5，12 ∶i ∶1，2[7]。鑒定為鼠傷寒沙門菌的接種于ESBLs耐藥培養基，挑取生長的菌株進行以下的實驗。

1.2.2 耐藥基因鑒定

采用DNA提取試劑盒提取基因組為模版，嚴格按照試劑盒說明書操作，PCR轉錄完成后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。產物由某生物工程技術服務有限公司測序。測序結果采用相關軟件進行編輯處理，隨后在采用BLAST程序在GenBank數據庫中進行比對，獲得準確的ESBLs基因型別。

1.2.3 藥敏試驗

挑取對數生長期的純菌落加入生理鹽水稀釋管中混勻，調整菌懸液濃度至0.5 McF，取60 μL菌懸液至肉湯接種管中，使用全自動菌液接種儀加入96孔藥敏板中，每孔100 μL，陰性對照孔加無菌營養肉湯培養液100 μL。將藥敏板放入恒溫培養箱中37 ℃培養18～20 h后判讀結果。以大腸埃希菌(ATCC 25922)作為質控菌株。根據美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的相應標準獲得相應敏感(Susceptible，S)、中度敏感(Intermediate，I)和耐藥(Resistant，R)的結果。

1.2.4 PFGE分型

按照PulseNet沙門菌PFGE的標準方法[8]，用Sea Kem glod agarose包埋，蛋白酶K裂解，Xba I酶切，所得DNA片段用Chef-mapper進行脈沖場凝膠電泳分型，PFGE后染色，用凝膠成像系統獲得圖譜，Marker為H9812，與從腹瀉病例中分離到的兩株鼠傷寒沙門氏菌A、B比較。

2 結果

2.1 耐藥基因檢測結果

6株鼠傷寒沙門氏菌耐藥基因PCR檢測，5株檢出blaCTX-M-14和blaTEM-1，1株只檢出blaTEM-1，其余基因未檢出。

2.2 藥敏結果

6株鼠傷寒沙門氏菌均為多重耐藥菌，均對氨芐青霉素、氨芐青霉素/復方新諾明、四環素、頭孢唑林、頭孢噻肟、磺胺異噁唑、米諾環素、氨曲南、頭孢吡肟、多西環素、鏈霉素產生耐藥，耐藥率100%，耐藥譜顯示菌株間耐藥情況均不相同，見表2。

表2 6株鼠傷寒沙門菌耐藥譜

2.3 PFGE結果

所檢6株鼠傷寒沙門氏菌經限制性內切酶XbaⅠ酶切電泳后，產生12～18條大小不同的片段(見圖1)，為不同帶型，且與從腹瀉病例中分離到的兩株鼠傷寒沙門氏菌A、B比較，帶型也不同。

圖1 6株鼠傷寒沙門氏菌PFGE結果注：M：H9812；A、B：為腹瀉標本檢出的鼠傷寒沙門氏菌

3 討論

細菌感染治療與防控的過程中，抗生素的使用具有重要意義。1980年第三代頭孢菌素的使用對β-內酰胺酶介導的耐藥細菌治療效果顯著，然后隨著藥物的使用，β-內酰胺酶在某些特定物種(大腸埃希菌)大量表達引起抗性，并且這些耐藥抗性在不同種細菌間進行傳播[9，10]。ESBLs能夠水解青霉素類抗生素、頭孢菌素(主要為第三代頭孢菌素，如頭孢他啶、頭孢哌酮等)和單環β-內酰胺類抗生素(氨曲南、卡蘆莫南等)，從而使細菌產生多重耐藥。ESBLs基因型主要為TEM、CTX-M、SHV、OXA，成全球分布，可由質粒攜帶，可通過融合、轉導和轉化等機制進行細菌間傳播轉移，從而擴大爆發，我國患者中臨床流行主要為CTX-M[11]。本研究中鼠傷寒的檢出率不高，僅為0.056%，但產ESBLs的菌株就占了17.6%，產ESBLs的菌株在鼠傷寒沙門氏菌中比例非常之高。6株菌中5株鼠傷寒沙門氏菌中均檢出CTX-M-14和TEM-1，表明本地耐藥基因以CTX-M-14和TEM-1為主。與曲梅等[12]關于北京地區沙門氏菌耐藥基因以TEM-1為主，CTX-M為輔的結果相似。6株鼠傷寒沙門菌均為耐12種以上抗菌藥物的多重耐藥菌，對氨芐青霉素、氨芐青霉素/復方新諾明、四環素、頭孢唑林、頭孢噻肟、磺胺異噁唑、米諾環素、氨曲南、頭孢吡肟、多西環素、鏈霉素產生耐藥，只有一株對氯霉素敏感，其余均耐藥，這與田云萍等[13]研究的云南本地鼠傷寒沙門菌耐藥情況不同，出現了耐更多藥的鼠傷寒沙門菌，說明本地耐藥情況呈多樣性。

PFGE分子分型技術是細菌分子分型同源性分析的有效方法，是國際認證的對爆發株區分和溯源的金標準[8]。本次試驗將分離得到的6株產ESBLs鼠傷寒沙門菌進行PFGE分型，并與腹瀉病例中分離到的鼠傷寒沙門菌做對比，顯示健康人群攜帶的鼠傷寒沙門菌都具有不同的帶型，且與腹瀉病例菌株存在差異，說明本地區鼠傷寒沙門菌存在多樣性。

本研究收集了健康服務從業人員體檢人群的肛拭標本進行耐藥菌研究，并獲得產超廣譜β-內酰胺酶的鼠傷寒沙門菌，獲得的6株菌均為耐12種以上抗菌藥物的多重耐藥菌，這與游興勇等[14]關于餐飲人員帶菌調查中出現的結果相識，說明健康人群中攜帶鼠傷寒沙門氏菌和多重耐藥的情況不容忽視。近年鼠傷寒沙門菌引起的感染多以散發形式報告，經分子分型研究，發現散發病例都有一定的聚集傾向[15]，但因缺乏流行病學信息，不能準確溯源。因此開展健康服務從業人員攜帶沙門氏菌監測，及時監控飲食衛生，開展預警，防止鼠傷寒沙門氏菌感染發生，對健康服務行業具有重要意義，同時也對沙門菌分布和耐藥傳遞調查具有重要意義。